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;提问：RT-PCR、WB、免疫组化、 FCM、ELISA、Bio-plex 用来 检测什么？ 有何区别？;SDS蛋白分析的利器； Western 既可以定性，又可以半定量,是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。 ; Western Blot又称免疫印迹，是指将蛋白样品转移到固相载体上，而后利用相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。是检测混合样品中单一特定蛋白的常用技术。 ; 研究检测样品中特异性蛋白质的存在 细胞中特异蛋白质的半定量分析 蛋白质分子的相互作用研究 ;;;;材料：HT-29细胞（收集25cm培养瓶一瓶） 试剂：RIPA蛋白抽提试剂 （裂解液有多种，根据需要选择） 检测 beta-actin，分子量43KDa 注意：为防止蛋白酶对蛋白的降解，提前前需加入1x coaktail (含PMSF) ，冰中 操作。 ;Procedure for Lysis of Monolayer-cultured Mammalian Cells Note: If desired, add protease and phosphatase inhibitors to the RIPA Buffer immediately before use. 1. Carefully remove (decant) culture medium from adherent cells. 2. Wash cells twice with cold PBS. 3. Add cold RIPA Buffer to the cells. Use 1mL of buffer per 75cm2 flask containing 5 × 106 HeLa or A431 cells. Keep on ice for 5 minutes, swirling the plate occasionally for uniform spreading. 4. Gather the lysate to one side using a cell scraper, collect the lysate and transfer to a microcentrifuge tube. Centrifuge samples at ~14,000 × g for 15 minutes to pellet the cell debris. Note: To increase yields, sonicate the pellet for 30 seconds with 50% pulse. 5. Transfer supernatant to a new tube for further analysis. ;1、贴壁细胞，去培养基，加入2ml预冷的PBS，洗2-3 次，最后移至EP管中，用滤纸弃干水分，25cm培养瓶一瓶加入120 μL配好的含多种酶抑制剂的RIPA裂解液，用枪头轻轻将细胞吹散，放在冰上裂解20-30min，期间可以用手弹一弹管子或者振荡数次以使细胞裂解充分。（注意不要引起过多气泡以免蛋白降解）。裂解完，14000转，4℃离心15分钟。取上清即得所需总蛋白。 组织样品：按100 mg组织加1 ml的RIPA裂解液（含酶抑制剂），用玻璃匀浆器匀浆。冰中裂解，余同上。 如果有些样品提时发现粘度较大（粘是因为含核酸多），可置于冰中进行超声数次；或者加核酸酶以降解核酸。 提完蛋白请分装（分装时一定要保证蛋白混合均匀），-80℃保存备用。 注意：不要全部变性，留些为变性的蛋白置于-80℃，以备用。 如果是检测磷酸化蛋白则提取时要加磷酸酶抑制剂。 ;; 在碱性环境下，蛋白质分子中的肽链结构能与Cu2+ 络合，将Cu2+还原成Cu+。 BCA 试剂可敏感特异地与Cu+结合，形成稳定的有颜色复合物。 在562nm处有高的光吸收值，颜色的深浅与蛋白浓度呈正比。;定量完用裂解液/高纯水 根据测出的浓度将各种蛋白调至等体积， 一般可调至上样量为10-15 μL;蛋白样品与上样缓冲液（5x）按4:1的比例混合后，放在100℃加热器中加热3-5min （提前开机预热），充分变性蛋白后迅速降温，离心，一周内要做的存至-20℃，一 个月内要做的放于-80 ℃冰箱。 如果蛋白浓度很高的话也可以选择蛋白上样缓冲液（2x）。;;1、应用于提纯过程中纯度的检测 2、用于分子量的检测 3、蛋白浓度测定（只跑浓缩胶，用已知浓度BSA对比） ;SDS原理; SDS：SDS-PolyAcrylamide Ge