纤维素柱填料的制备及其在汇编.docx

纤维素柱填料的制备及其在超氧化物歧化酶提纯中的应用（武汉大学化学与分子科学学院，武汉?430072）摘要：本实验采用由一种廉价易得的纤维素，通过溶解和搅拌，制得尺寸排阻色谱的填料，并由此种填料分离猪血中的超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase，缩写为SOD，）,并采用邻苯三酚的自氧化来测酶的活性。关键词：体积排阻色谱，梯度洗脱，纤维素填料，超氧化物歧化酶0 引言超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，缩写为SOD，）,它广泛存在于各类生物体内。按其所含金属离子的不同分为3 种：铜锌超氧化物歧化酶（Cu.Zn-SOD）、锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)和铁超氧化物歧化酶（Fe-SOD）。，它是一种重要的自由基清除剂，能专一性的清除超氧化物阴离子自由基O2-而保护细胞，能治疗多种炎症、放射病、自身免疫性疾病和抗衰老，对生物体有保护作用。在猪血液里，Cu.Zn-SOD 与血红蛋白等共存于红血球。在一系列萃取和离心后，过DE-32 纤维素阴离子交换柱可得到进一步纯化，得到较纯的SOD。1 实验部分 1.1实验仪器与试剂1．试剂20%NaOH,SPAN-80，短线绒，4%硫酸，95%乙醇，氯仿，K2HPO4.3H2O ,K2HPO4, 0.9%NaCl, 丙酮，10m mol/L HCl, 邻苯三酚（用10mmol/L HCl作溶剂配制，4℃下保存），新鲜猪血500mL，2.5%草酸钾，甲醛溶液，三羟甲基氨基甲烷（Tris-）。2.仪器烧杯（250mL、500mL、50mL 各2 个，800mL 一个），量筒（50mL、100mL）,1000mL 分液漏斗（1 个），药匙，洗瓶，抽滤装置（抽滤瓶、布氏漏斗各2个），玻璃搅拌棒，恒流泵（1），自动部分收集器（1），淋洗液瓶（2），电磁搅拌器（1），微量进样器（25μL）,玻璃色谱柱（1.5×20cm），试管100 支（5ml），台秤（2），机械水泵（1），真空干燥器（1），电炉（1），注射器及针头，回收瓶。紫外分光光度计（UV），荧光光度计，分析天平，低温高速离心机。2 实验步骤1. 纤维素柱填料的制备①将14gNaOH,24g尿素溶于162g蒸馏水中配制7wt%NaOH/12wt%尿素水溶液200ml；②将上述溶液置于冰箱中冷冻至-12.3℃；③将冷冻好的溶剂取出，加8.4g棉短绒浆，室温下快速机械搅拌几分钟，纤维素即完全溶解。将其置于冰箱中待用；④准确称取3gSpan-80加入300ml的液体石蜡中，完全溶解后，加入到烧瓶中，以400r/min搅拌30min；⑤用注射器向其中缓慢加入准备好的纤维素溶液100ml,在常温下乳化1h；⑥在水浴环境下，升温至45℃保持2h；⑦滴加10%的盐酸，酸化到pH值接近于7；⑧停止搅拌，静置分层。回收上层石蜡，下层纤维素微球用蒸馏水和乙醇多次洗涤备用。2.酶的制备（1）取新鲜猪血500mL（已予先加入50mL 2.5%草酸钾作为抗凝剂），3000rpm 离心20min 除去血浆，收集红细胞约250mL，加入等体积的0.9%NaCl 溶液，用玻璃棒搅拌充分洗涤，3000rpm 离心20min，弃去上清液（如此反复3 次），收集洗净的红细胞放入800mL 烧杯中，加250mL 重蒸水，将烧杯置于冰浴中搅拌溶血40min 以上，得溶血液500mL。（2）往溶血液中缓慢加入在4℃下预冷过的95 0/0 的乙醇125mL（0、25 倍体积），然后再缓缓加入在40C 下预冷过的氯仿75mL（0.15 倍体积），搅拌15min，室温下3000rpm 离心20min，弃去沉淀（血红蛋白），收集上清液约330mL（留样2mL 测酶活性），此即酶的粗提液。（3）往上述液中加入K2HPO4·3H2O（按43gK2HPO4·3H2O/100mL 粗提取液的比例），转移到分液漏斗，振荡后静置分层（约15min）。收集上层乙醇-氯仿相（微浑浊），室温下离心（3500rpm）25min，弃去沉淀，得上清夜约150mL（留样1.5mL 测酶活性）。（4）向上一步所得上清夜加入0.75 倍体积在4oC 下预冷过的丙酮，Cu·Zn-SOD 便沉淀下来。室温下3500rpm 离心20min ,收集灰白色沉淀物。将此灰白色沉淀物溶于约5mL 重蒸水中（呈悬浮状），在4℃下，在250mL 2.5m molL-1 pH7.6 的磷酸钾缓冲液中透析，每隔0.5h 换透析液一次，共换4-5 次。透析内液如出现沉淀，需在室温下3500 rpm 离心，弃去沉淀，收集上清液7mL（留样0.5mL）。（5）纤维素柱层析：将实验1 所得柱填料1#和2#按体积比1:1 混合并填充玻璃色谱柱，柱体1.5×20cm，填装时不要混入气泡，同时轻轻敲打管壁，使填料填充紧密，均匀。装好后