HTRF技术介绍.PDFVIP

HTRF? 技术介绍 快速、稳定、不需洗涤、操作简单、易于自动化和微型化。上述优势使得 Cisbio 的 HTRF?技术一直是药物研发领域的领先技术之一。该技术已经在知名医药公司、 生物技术公司和学术研究机构应用了 10 年以上。 HTRF?（均相时间分辨荧光，Homogeneous Time-Resolved Fluorescence ）是 用来检测纯液相体系中待测物的一种常用方法，是研究药物靶标的理想平台。该 技术结合了荧光共振能量转移（FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer） 和时间分辨荧光 （TRF, Time-Resolved Fluorescence)）两种技术。这种结合将 TRF 的低背景特点和 FRET 的均相实验方式融合在一起，使得 HTRF?技术拥有如下优 势：实验方式灵活、可靠，并且具有更高的灵敏度、更大的通量，实验结果的假 阳性率较低。虽然 HTRF?也是基于 TR-FRET 的化学技术，但它的许多特点把它与 其它 TR-FRET 产品区分开来。这些特点包括使用了镧系元素（铕和铽），从而具 有非常长的半衰期，很大的 Strokes shift（如 右图所示，Eu3+ Stroke’s shift 300 nm）；同 时，镧系元素与络合的穴相结合，这种结合的 穴状物与其它所有 TR-FRET 产品使用的螯合 物相比，显著增加了稳定性（可耐受低 pH 值、 金属离子、DMSO、EDTA 等）；专利的比值测 量能矫正淬灭和样品带来的干扰。 FRET 技术简介 FRET 技术利用了两种荧光基团的能量转移，这两种荧光基团分别称为（能量） 供体和（能量）受体。供体被外来能源激发（例如闪光灯或激光），如果它与受 体在足够近的距离之内，可以将能量共振转移到受体上。受体受到激发，发出特 定波长的发射光。 1 将供体和受体分别与相互作用的两个生物分子结合，生物分子的结合可以将 受体和供体拉到足够近的距离，产生能量转移。由于受体分子的发射光来自于能 量转移，所以在实验中不需要将未结合与已结合的分子分开，即不需要洗涤步骤。 这种均相的实验方式操作简单，而且减少了实验时间和花费。 一般地，在 FRET 实验中使用的供体和受体是快速荧光基团，半衰期非常短。 传统 FRET 技术的限制因素是由背景荧光引起的，其来自于样品成分，包括缓冲 液、蛋白质、化合物和细胞裂解液。检测到的荧光强度必须对这些自发荧光进行 校正，极大地影响了实验灵敏度，并使数据分析变得复杂。背景荧光非常短暂（寿 命为纳秒级），可以利用时间分辨荧光方法将其去除。 TRF 技术简介 如前所述，在生物溶液或血清 中的很多化合物和蛋白质是自发 荧光的，利用传统的快速荧光基 团进行检测极大限制了实验灵敏 度。使用长寿命的荧光基团结合 时间分辨的检测方式（在荧光激 发和发射检测之间有一个时间延 迟）可将快速荧光的干扰降到最 低。 时间分辨荧光（TRF）利用稀土元素中镧系元素的独特性质。在 TRF 中常用的 镧系元素是钐（Sm）、铕（Eu）、铽（Tb）和镝（Dy）。与传统荧光基团相比，它 们具有大的 Stokes shifts 和非常长的发射半衰期（从微秒到毫秒），这使它们在 生物学荧光应用领域中日益重要。 通过直接激发使镧系元素离子产生荧光是不容易的，因为这些离子很难吸收 光子。镧系元素必须首先与有机分子形成复合物，有机分子收集光子并通过分子