离心机-硕士研究生幻灯片.pptVIP

细胞分离分析仪器---离心机(centrifuge);生物技术的定义;细胞培养;组织形态学实验方法;组织器官生化代谢分析方法;四大经典的生化技术;内容提纲;离心技术;相关的几个概念;;离心力（centrifugal force，Fc）：它的出现是因为物体所受的外力小于做圆周运动的向心力。 离心力F可以表示为： F=mω2r ω:旋转角速度(弧度／秒) r:旋转体离旋转轴的距离(cm) m:颗粒质量 ; RCF(Relative centrifugal force）相对离心力：就是离心力场和重力场g的比值，即离心力场相当于多少个g。 沉降系数(S):是指单位离心立场下的样品的沉降速度。它与样品的质量和密度成正比。书98页表3-6-2介绍了某些生物样品的沉降系数及离心条件。 rpm或者r/min:离心机转速的表示方法，一般对于低速离心机通常用这个参数。 ;离心机(centrifuge);二、离心机的工作原理;扩散现象： 重力场中扩散现象是无条件的，绝对的。特别是对于病毒和蛋白质类小分子物质，扩散对物质的沉降影响更大。如何克服？？ ; 离心机即可以通过转子的高速运动产生的强大的离心力，从而加快微粒在离心力场中的沉降速度，达到分离的目的。 （二）离心力场中颗粒的分离： 当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，离心力(F)的大小取决于离心转头的角速度(ω，r/min)和物质颗粒距离心轴的距离(r，cm)。 ; 通常，Fc常用相对离心力也就是地心引力的倍数表示。即把F值除以重力加速度g得到离心力是重力的多少倍，称作多少个g。 “RCF”和转速可以通过下列的公式进行换算： RCF = 1.119×10－5×(rpm)2 r 例如：离心机转头平均半径是6cm，当转速是用60000?r/min表示时，离心力240000×g，表示此时作用在被离心物质上的离心力是日常地心引力的24万倍。? 也可由下图得出：;;计算颗粒的相对离心力时，应注意离心管与旋转轴中心的距离“r”不同，即沉降颗粒在离心管中所处位置不同，则所受离心力也不同。 在报告超离心条件时，通常总是用地心引力的倍数“×g”代替每分钟转数“rpm”，因为它可以真实地反映颗粒在离心管内不同位置的离心力及其动态变化。科技文献中离心力的数据通常是指其平均值（RCFavg），即离心管中点的离心力。;离心机是分离细胞器及各种大分子基本手段。 转速10－25kr/min的离心机称为高速离心机。 转速25000r/min，离心力89Kg者称为超速离心机。 超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500kg。 ;三、常用的离心方法;原理：利用样品中各种组分的沉降系数不同(S)而进行分批分离。通常两个组分的沉降系数差在10倍以上。 用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器，仅仅适合粗提或者样品浓缩。 ;其特点： 介质的密度均一 速度由低向高，逐级离心 分辨率不高，往往适合样品的粗提 对分离的细胞而言，沉降顺序依次：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。 可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。 ;Low speed;;;（二）密度梯度离心(isodensity centrifugation); 优点： ①分离效果好，可一次获得较纯颗粒。 ②适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒。 ③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性。 ;;1. 速率区带离心法 velocity sedimentation ;操作注意事项;用途：分离密度相近而沉降速度不等的细胞或细胞器。 ;2.等密度沉降法 isopycnic sedimentation;操作注意事项;Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation;蔗糖 密度 梯度 溶液 的制 备 ; 梯 度 离 心 ;梯度 溶液 的分 部收 集 ;收集区带的方法有许多种： （1） 用注射器和滴管由离心管上部吸出。（2） 有针刺穿离心管底部滴出。（3）?用针刺穿离心管区带部份的管壁，把样品区带抽出。（4）用一根细管插入离心管底，泵入超过梯度介质最大密度的取代液，将样品和梯度介质压出，用自动部分收集器收集。 ;离心方法的选择;例如：线粒体的分离;（三）分析离心法;沉降速度法：主要用于样品纯度检查。 沉降平衡法：常用的测量绝对分子量的方法。 等密度区带分析离心法：主要用在核酸的分析和研究中。 ;超速离心机工作原理图解;三、离心机的分类与结构; 高速离心机：最大转速为20000～25000rpm，最大容量