5-3-2Q-PCR课案.ppt

* 2 主要核酸操作技术 核酸凝胶电泳技术 核酸分离 PCR技术 突变位点的检测 DNA/cDNA文库的构建 基因克隆技术 实时定量PCR (Real time Quantitative PCR) Molecular Biology Course 主 要 内 容 实时定量PCR原理 实时定量PCR的几种方法介绍 Molecular Biology Course 实时定量PCR原理 ---常规PCR 常规PCR技术： PCR后借助电泳对扩增反应的终产物进行定量及定性分析 DNA Engine S1 S2 M 只能对终产物进行分析,无法对起始模板准确定量 实时定量PCR 原理 ------实时原理 实时定量PCR技术(Real time Quantitative PCR，Q-PCR) ： 荧光探针事先混合在PCR反应液中，在反应过程中，荧光探针与大片段DNA结合后，被激发出荧光。 对PCR扩增反应中每一个循环的反应产物实时进行定量和定性分析，基本消除了在测定终端产物时较大的变异系数。 一小段单链DNA或者RNA片段（大约是20到500bp），用于检测与其互补的核酸序列 实时荧光定量PCR 原理 ----------- 扩增曲线 扩增曲线图： 横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度。 每个循环进行一次荧光信号的收集 荧光基团 荧光检测元件 实时定量PCR 原理 -------Ct值的定义 荧光信号的阈值 （threshold ）： 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline） 真正的信号:荧光信号超过域值 横轴：PCR反应循环数 纵轴：荧光信号量 Ct值： 荧光信号达到设定的阈值时的循环数。 不同浓度模板进行扩增，Ct值会有差异。 实时定量PCR 原理 --------- 荧光定量原理 模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小； Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中模板的浓度； 非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon 实时定量PCR 原理---DNA产物的荧光标记（探针） 主 要 内 容 实时定量PCR原理 实时定量PCR的常用方法 Molecular Biology Course SYBR Green 法 TaqMan法 分子信标法 实时定量PCR 方法 1 ---------SYBR Green I法 SYBR Green I SYBR Green I 法工作机理 SYBR Green I 能结合到双链DNA的小沟部位 SYBR Green I 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green I发荧光，在此阶段收集荧光。 SYBR Green I Cycle number Flourescenc Ck 102 Ck 104 Sample Cycle number Log of DNA concentration SYBR Green 法定量原理 模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少； Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品Ct值，计算出样品中模板的浓度。 SYBR Green I 法 - Primer特异性对反应的影响 选择多对不同引物进行对比实验 融解曲线分析 利用SYBR Green I 法定量检测样品DNA SYBR Green I法 ----- 优缺点 对DNA模板没有选择性 ----适用于任何DNA 使用方便 -----不必设计复杂探针 非常灵敏 便宜 优 点 容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性 但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件 对引物特异性要求较高 缺 点 主 要 内 容 实时定量PCR原理 实时定量PCR的常用方法 应用前沿 Molecular Biology Course SYBR Green 法 TaqMan法 分子信标法 与目标序列互补 实时定量PCR 方法2 -------TaqMan法 TaqMan---水解型杂交探针 TaqMan探针三要素： 5′端和 3′端标记有两个荧光基团 (R和 Q)； 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收（荧光共振能量转移） ，无荧光； R与Q分开，R在激发