细胞培养流程以B16细胞为例.docVIP

B16细胞培养流程 细胞培养所需器材和药品：15毫升的离心管，枪（1000ul），培养瓶，离心机，PBS，培养基，一次性吸管，冻存液，冻存盒，冻存管（1500ul）。 细胞复苏流程 1. 首先，在超净台中将两支吸管，一个培养瓶，和两只十五毫升离心管放入，用紫外杀菌半个小时左右。定时半个小时。与此同时，将盛有培养基的瓶子放入37摄氏度左右的水浴中。 2. 半小时过后，关闭紫外，打开普通照射和弱风，用酒精对手消毒，进入超净台，对超净台用酒精消毒，之后点燃酒精灯。 取两只离心管用酒精灯火焰对盖口消毒后，打开盖子，再烧一次瓶口和瓶盖，将去盖的离心管放在离心管架上，将一只消毒的吸管放入其中一个离心管中。在水浴中取出培养基的瓶子，酒精消毒后放入超净台，撕去胶条，烧盖口，打开后再次烧盖子和瓶口。取第二只吸管吸取2毫升培养基放入打开盖的无吸管的离心管中，将吸管放入盛有培养基的瓶子中。 3. 在液氮中取出冻存的细胞，放入水浴，直到冻存管中剩余一小块冰时拿出，酒精消毒后用另一只吸管放入已加入培养基的离心管中，吸管用后仍放在无培养基的离心管中。将有细胞的离心管烧口和盖后，拧紧盖子再次烧盖口，拿出超净台，取含有同体积液体的离心管与含有细胞的离心管对着放入离心机中，定时3分钟。 4. 时间到了之后，取出含细胞的离心管，酒精消毒后放入超净台，烧盖口后打开，再次分开烧口和盖子，然后用第一只吸管排尽空气后吸取上清液放入废液缸中，吸管放入之前的离心管中。用培养基中的吸管吸取培养基放入只剩细胞的离心管中，用同一只吸管吹打，将细胞吹散。 5. 将空的培养瓶用火焰按上述方法消毒后，用吸培养基的吸管将细胞液放入培养瓶中，注意吸管口不能碰到瓶口也不能进入瓶口，注入细胞液后若培养基少可再去新的吸管加入适量培养基，若不少则不必再加。将培养瓶平放，水平方向轻晃几下， 用火焰对口和盖消毒后盖上盖子，再次烧口和盖。拿出超净台在显微镜下观察一下，最后迅速放入培养箱中，放入培养箱后将瓶口松开一圈，迅速关紧培养箱的门。 6. 整理超净台，将培养基的瓶子火焰消毒后用胶条封口，其余用过的离心管和吸管扔掉，熄灭酒精灯，用酒精再次对超净台消毒，关上超净台的门后关闭超净台的电源。 细胞换液流程（在上次换液或者复苏24后） 将三支吸管和两只离心管放入超净台进行30分钟的紫外照射，同时将PBS和盛有培养基的试剂瓶放入37摄氏度水浴中。 30分钟过后，关掉紫外照射，打开弱风和普通照射，对手酒精消毒后进入超净台，对超净台进行酒精消毒，点燃酒精灯，对两只离心管烧口打开再烧口和盖后放在离心管架上。 从水浴中取出PBS和培养基试剂瓶消毒后放入超净台，撕去胶条，烧口后打开，再次烧口和盖子，取一只干净的吸管放入培养基试剂瓶中，另一支吸管放入PBS试剂瓶。 从培养箱中取出细胞（手进入培养箱前消毒，进入培养基后迅速拧紧培养瓶的盖子，迅速拿出），迅速关上箱门。对培养瓶消毒后拿进超净台，烧口后打开，再次烧口和盖，将培养瓶倾斜使旧的培养基集中在一个角上，用第三支吸管吸出旧的培养基，加入PBS清洗（可以将培养瓶平放，轻晃，使清洗更全面），清洗后用同一支吸管将PBS吸出，加入新的培养基后，将培养瓶放平，使培养基完全浸泡细胞，烧口和盖，封盖，再次烧口后将培养瓶放入培养箱，放入前可以在显微镜下观察一下，放入时的注意事项与复苏后放入培养箱时一样。 对手消毒后进入超净台，收拾超净台，将PBS和培养基经过烧口和盖后盖上，再次火焰杀菌后用胶条封口，拿出后放入冰箱冷藏室（2—8摄氏度），将用过的离心管和吸管放入固体废弃缸，拿出超净台，熄灭酒精灯，再次对超净台酒精消毒后关闭超净台的门，关掉电源。 传代流程 准备三只吸管，几个培养瓶，三只离心管，至于超净台中，紫外灭菌30分钟左右。定时30分钟。同时将培养基和PBS放入37摄氏度的水浴，将胰蛋白酶放在室温环境中解冻。 30分钟过后，手用酒精消毒后，从培养箱中迅速取出需要传代的细胞（取出前注意迅速拧紧瓶盖），在显微镜下观察一下，酒精消毒后放入超净台。将三支离心管烧口打开，分别标注后放在离心管架上。 取一支吸管插在培养基试剂瓶中，一支放在PBS试剂瓶中。将有细胞的培养瓶烧口，打开，再次烧口和盖，将旧液一次性倒入废液缸，用吸管吸取PBS进行清洗，用吸管吸取PBS在细胞层上淋洗，淋洗后的吸管插在一支离心管中，用作废液吸取。淋洗后将培养瓶中的PBS倒掉。 用1000ul的枪吸取1毫升的胰蛋白酶液注入细胞培养瓶中，水平轻晃几下，将瓶子烧口和盖，盖上后再次烧口，放入培养箱中（也可以水平放在超净台上），两分钟过后拿到显微