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实验七 蛋白质浓度测定（Folin-酚试剂法）13生物基地 201300140059 刘洋 2015-05-19同组者：张奕一、实验目的1.学习分光光度计的原理和使用方法。2.熟悉并掌握福林（Folin）—酚法测定蛋白质浓度的原理和方法。3.进一步掌握比色法或分光光度法，准确测定未知样品。4.学习并掌握移液枪的使用方法。5.学会绘制标准曲线图。二、实验原理蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定蛋白质浓度从它们的物理化学性质，如折射率，比重，紫外吸收测定而得知，或化学方法，如定氮，双缩脲反应。Folin—酚法是一般实验室中经常使用的方法。Folin—酚法是双缩脲法的发展，反应的第一步涉及碱性溶液中铜一蛋白质复合物的形成，然后这个复合物去还磷钼酸—磷钨酸试剂（Folin试剂），产生深蓝色（钼蓝和钨蓝混合物）。Folin—酚法灵敏度高，较双缩脲法灵敏100倍。Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多。缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。所测蛋白质样品中若含酚类及柠檬酸均有干扰作用，浓度较低的尿素（约0.5%左右），胍（0.5%左右），硫酸钠（1%），硝酸钠（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%）乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色反应影响，这些物质浓度高时必须做校正曲线。含硫酸铵的溶液只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液即可显色测定。若样品酸度较高，显色后色浅。则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1—2倍。进行测定时，加Folin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质量达5μg。通常测定范围是5～100μg。三、实验器材1.材料血清（使用前稀释200倍）2.试剂1.标准酪蛋白溶液：200μg/ml。2.Folin-酚试剂甲液：（碱性铜溶液）A液：4%Na2CO3：0.2M NaOH=1:1B液：1%CuSO4：2%酒石酸钠=1:1临用时，按甲：乙=50：1混合使用。混合后的溶液一日内有效，即现用现配。3.Folin-酚试剂乙液：将100g钨酸钠、25g钼酸钠、700ml蒸馏水、50ml85%磷酸以及100ml浓盐酸置于1500ml的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回流10小时。再加入硫酸锂150g，蒸馏水50ml及液溴数滴，开口煮沸15分钟，在通风橱内驱除过量的溴。冷却，稀释至1000ml，过滤，滤液成微绿色，贮于棕色瓶中。临用时，用标准氢氧化钠溶液滴定，用酚酞作指示剂（由于试剂微绿，影响滴定终点的观察，可以将试剂稀释100倍再滴定）。根据滴定结果，将试剂稀释至相当于1mol/L的酸（稀释一倍左右）。贮于冰箱中可以长期保存。4.去离子水。3.器具试管及试管架、移液枪以及塑料枪头、722型分光光度计、烧杯、标签纸等。四、实验步骤1.标准曲线的制作。取6支洗净并试管，分别加入0, 0.2 , 0.4, 0.6, 0.8, 1.0毫升标准酪蛋白溶液（500微克/毫升）,然后用水补足到1.0毫升，并用标签纸做好标记，编号依次为0、1、2、3、4、5，不要混淆试管。接着按顺序向各管分别加入5毫升Folin—酚试剂甲液，混匀（使用专门混匀液体的仪器），30℃水浴保温10分钟。保温结束后取出，再依次向各管加入0.5毫升Folin—酚试剂乙液，立即混匀（使用专门混匀液体的仪器），30℃水浴保温30分钟。保温结束后取出，于640nm处比色。每次测定前，要先润洗比色管。记录每个试管中溶液的比色值，然后以光密度（0.D）为纵坐标，以酪蛋白溶液浓度为横坐标，绘制酪蛋白的标准曲线。2.血清样品的测定。取3支试管，分别加入0.2ml的血清稀释液（稀释的目的是使其蛋白质含量在酪蛋白标准曲线范围之内），再分别加0.8ml的去离子水使使试管中样品液体积达到1.0ml。然后分别贴上标签纸，编号为7、8、9。 接着按顺序向各管分别加入5毫升Folin—酚试剂甲液，混匀（使用专门混匀液体的仪器），30℃水浴保温10分钟。保温结束后取出，再依次向各管加入0.5毫升Folin—酚试剂乙液，立即混匀（使用专门混匀液体的仪器），30℃水浴保温30分钟。保温结束后取出，于640nm处比色。每次测定前，要先润洗比色管。记录每个试管中溶液的比色值。