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分子细胞生物学 分子细胞生物学的研究方法； 近年来蛋白质和核酸的结构和功能研究进展； 生物膜运输物质的分子机理； 细胞各部位蛋白质的合成和定向运输的分子机理； 细胞核的分子结构以及细胞核和细胞质之间物质运输的分子基础； 细胞信号传导的分子机理。 第一章 分子细胞生物学学科简介和研究方法 本章重点难点：分子水平上的操作技术。 分子细胞生物学的研究对象和内容 p1-2 分子细胞生物学与其他学科的关系 p1-2 分子细胞生物学的研究方法- （一）、研究细胞的组成和结构 荧光显微镜下鉴别细胞的组成和结构p2-4 免疫荧光法 活细胞研究 检测局部Ca2+浓度和细胞内的pH 共聚焦扫描显微镜展示细胞内物质的立体分布 在电子显微镜下鉴别细胞中的各种蛋白质的分布和超微结构p4 利用抗体和抗原特异性结合的原理，电子致密度大的物质（金颗粒）作为标记， 蛋白A起桥梁作用（蛋白A能同抗体Fc片段结合）。 3．鉴定蛋白质的亚细胞定位或特殊细胞定位p5 （1）将目标基因与标记基因（荧光蛋白基因GFP、RFP、YFP）融合， 确定目标蛋白质的亚细胞定位 （2）用目标基因的启动子驱动标记基因，确定目标蛋白质在不同细胞中的分布， 时空表达特点等 （3）荧光显微镜或共聚焦扫描显微镜 例如：GUS，葡糖醛酸酶，可催化化学反应，加入底物后有GUS表达的位置显蓝色。 4.蛋白质亚细胞定位和超微结构定位的对比鉴定p6 标记蛋白miniSOG（小型单线痒制造者，有黄素蛋白、向光蛋白2等），表达后会发出绿色荧光，蓝光下miniSOG产生单线态氧可局部催化二氨基联苯胺（DAB）聚合形成嗜锇产物，嗜锇产物店子致密度高-电子显微镜下可见。 5.检测大量元素和微量元素在细胞内的分布p6 （1）用Na2S沉淀金属离子 （2）用透射电子显微镜-能量散射广谱仪分析细胞营养元素的分布 （二）、细胞的分离和细胞器的分离 流向细胞分类器，荧光激活细胞分类器p7 具体特点见ppt 激光捕获微分离系统p7 具体特点见ppt 激光捕获显微切割即Laser capture microdissection (LCM) technology是在不破坏组织结构，保存要捕获的细胞和其周围组织形态完整的前提下，直接从冰冻或石蜡包埋组织切片中获取目标细胞 ，成功地解决了组织中的细胞异质性问题，从而可以进行纯细胞的蛋白质组研究。其原理是用乙烯醋酸盐聚合体膜覆盖在被选择的细胞上 ，然后用红外激光熔化膜，这时膜与组织在目标位置牢固结合，当膜被提起时，仅目标细胞留在膜上，这些细胞直接在膜上进行裂解，再进行 2DE分离及蛋白质组分析或用 SELDIT0F进行分离与分析。此方法大大提高了随后分析(2DE，SELDI．TOF等)的重现性和准确性，是目前较为理想的细胞提取工具，已经用于膀胱癌、结肠癌等标本的准备 细胞亚微结构的分级分离p7-8 差速离心法.（根据细胞亚微结构的颗粒大小和密度差别，采用不同离心速度分离各种结构） 密度梯度离心法（根据亚微结构的密度差别达到离心的目的，用蔗糖、甘油或氯化铯作为密度梯度的介质，高速离心机40000r/min，被分离物质分布在相应的密度带内） 激光剪 （三）、生物大分子的操作 放射性同位素是跟踪生物大分子活动必不可少的工具 放射自显影术（主要用于核酸）p8-9 分类a：整体放射自显影（用肉眼观察，RFLP技术中，32p标记的DNA的放射自显影） b:体外培养细胞的放射自显影（借助显微镜观察，将细胞放在盖玻片上培养） c:显微（超微）放射自显影（借助显微镜或电子显微镜观察，含放射性同位素组织 切片的放射自显影） 感光材料：X光胶片，液体乳胶 放射性同位素的定量测定p9-10 种类：a：盖革计数器（常用于检测污染，特点见ppt） b: 液闪计数器 （特点和例子见ppt） （3）脉冲-跟踪技术p10-11（采用同位素跟踪技术研究生物大分子代谢活动的方法） 基本步骤和研究实例见ppt 确定核酸和蛋白质分子的大小以及分离和纯化核酸和蛋白质 电泳法p11 （需要从凝胶中进一步分离大分子，分离效果好，分离量小） 琼脂糖凝胶p11 b. 电泳脉冲电泳p11 c. 等点聚焦 p12 d.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳p12 e.双向电泳p12 f. PAGE p12 脉冲场凝脉电泳(Pulsed field gel electrophoresis，PFGE)，是近年发展起来的一种重要的分离大分子量线性DNA分子的电泳技术。 PFGE的基本原理是在琼脂糖凝胶上外加交变的脉冲电场，其方向、时间和电流大小交替改变，每当电场方向发生改变时，大分子DNA便滞留在凝胶孔内，直至沿新的电场轴重新定向后，才能继续向前泳动，DNA分子越大，这种重新定向需要的时间就越长，当