DNA及寡核苷酸探针在原位杂交组织化学.pdfVIP

中国试剂网 3.18.14 DNA 及寡核苷酸探针在原位杂交组织化学 一、DNA 探针的应用 虽然一般认为 DNA 探针敏感度不如 cRNA 探针，但在病毒的检测等领域中 DNA 探针仍得到广泛的应用。 在原位杂交细胞化学的操作步骤方面与 cRNA 探针基本相同，所不同的是： （1）杂交时需先在高温 80～95℃短时处理，使 DNA 探针及细胞内靶 DNA 变性， 解离成单链，迅置于冰上冷却。然后置于 37℃～42 ℃杂交过夜。（2 ）RNA 酶的 溶液的冲洗不能减低背景，因此，在操作步骤中省略此步。 （一）地高辛-碱性磷酸酶（Dig -AKP ）标记DNA 探针在石蜡包埋切片检测 病毒 DNA 中的应用 1．组织前处理 （1）固定：组织以 10%中性福尔马林液或Bouins 液固定，常规石蜡包埋， 切片厚 4～6μm ，粘附于涂有粘附剂的玻片上，入烤箱 60～80℃6～8h，使切片 更紧贴玻片。 （2 ）脱蜡：二甲苯 10min ×2，自 100%乙醇，90%，70%，50%，30%各 5min 。 入 PBS （含5mmol/l MgCl2,pH7.3～7.4 ）10min×2。入0.2n HCl 20min 以进一步 去除蛋白。 （3 ）50℃2×SSC ，含 5mmol/l EDTA 溶液中 30min 。 （4 ）蛋白酶K （1μg/ml 溶于 0.1mol/l PBS 中，）37℃20～25min 。 （5 ）0.2mol/l 甘氨酸液：室温 10min，中止蛋白酶反应。 （6 ）4%多聚甲醛（PBS 新鲜配制）：室温20min 。 （7 ）PBS/5mmol/l MgCl2 漂洗 10min×2。 （8 ）脱水，自低浓度到高浓度，无水乙醇各3min，空气干燥。 2 ．预杂交封闭非特异性杂交位点，20μl/每张切片，42 ℃水浴半小时。 3 ．杂交 10～20μl/每张切片，加盖硅化盖玻片，将切片置于 95℃min ，使探 针及病毒 DNA 变性，然后迅速置于冰上 1min （也有报告用乙醇使之冷却的）， 然后将切片置于盛有 2×SSC 湿盒内，42 ℃过夜（16～18h）。 4 ．杂交后漂洗 （1）2×SSC 液内振动移除盖片。 中国试剂网 3.18.14 （2 ）2×SSc 55 ℃10min×2。 （3 ）0.5×SSc 55℃5min×2 。 （4 ）缓冲液II （含0.5%封阻试剂，用缓冲液 I 溶解）37℃30min 。 （5 ）缓冲液I （10mmol/l Tris –HCl, 15.0mmol/L NaCl pH7.5）15min，室温。 （6 ）酶标地高辛抗体（1：5000，应用缓冲液I 稀释）37℃30min 。 （7 ）缓冲液i 15min×2 室温。 （ 8 ）缓冲液 III （100mmol/l Tris -HCl, 100mmol/L NaCl, 50mmol/L MgCl2,pH9.5 ）室温2min 。 5 ．显色 （1）显色液配制：缓冲液III ：1ml 中加入4.5μl 四氮唑蓝（NBT ），3.5μl X- 磷酸盐（5-溴-4-氯-3 吲哚磷酸盐（BCIP 配成））。30μl/每张切片，置暗处显色 30min 到 2h 。定时抽查切片，镜检其显色情况。 （2 ）缓冲IV （10mmol/l Tris –HCl, 1mmol/L EDTA, pH8.0）10min 终止反应， 甲绿复染5min，二甲苯透明，DPX 封固，镜检。 （二）荧光标记 DNA 探针的应用 1．概述在原位杂交细胞化学中荧光标记 DNA 探针（Fluorescence in situ DNA hybridisa －tion , FISH ）的应用在细胞培养和染色体铺片（见二十一章 ）中较 为广泛。FISH 属于非放射性标记，其优点在于简便，快速，其敏感性可与放射 性同位素标记核酸探针相等。不少实验室报告应用 F