层析介质的寿命和清洗方法.PDF

GE Healthcare ?KTA Club 层析介质的寿命和清洗方法 一、层析介质寿命的判断标准： 判断层析介质的寿命主要以下列参数与产品生产的 SOP 做对比，如不在 SOP 的控制范围 内，说明层析介质应该更换了。 1. 产品的的性质：产品的纯度、收率 2. 杂质的性质：杂质的含量 (HCP、DNA、聚体) 3. 层析介质在生产中的参数：载量、洗脱峰的保留时间，洗脱峰的对称性等 4. 层析介质的运行的参数：压力、流速、柱高、再生、在平衡的 UV/pH/Cond 等参数 5. 泄漏：层析介质的配基泄漏 (尤其为亲和介质的配基泄漏是否在规定的水平) 二、层析介质的清洗方法： 在位清洗（CIP）和在位消毒（SIP）对延长介质的使用寿命十分重要。对于不同的污染物 来说，有不同的清洗条件，以下介绍不同的污染物使用的清洗试剂。 ? 可溶性杂质蛋白的清洗 离子交换介质? CIP?柱床体积? 接触时间? 2M?NaCl 0.5? 疏水层析介质? CIP 柱床体积? 低离子强度的缓冲液或水 30% 异丙醇 2-3 2-3? ? 沉淀蛋白杂质的清洗 方法? CIP 柱床体积? 10‐15min 接触时间? 10-15min 10-15min 接触时间? a. 1M NaOH b. 水 c. 2M NaCl (除HIC) 或 1M NaOH + 1M NaCl 或使用盐酸胍 4 CV 1.5CV 1CV 4CV? 需要优化? 2h 2h 2h? ? 疏水性蛋白杂质或脂蛋白杂质? 方法? CIP 柱床体积? 接触时间? 0.5-1M NaOH 4? 1‐2h ? 脂类杂质的清洗? 方法? CIP 柱床体积? 接触时间? a. 0.5-2M NaOH 4 1-2h b. 0.5% 非离子去污 4? 4? 1‐2h 1‐2h? 对于吸附较强的脂类杂质可以优化 70% 乙醇，30%异丙醇的方法 1．杂蛋白的清洗： 在物料中含有大量的杂蛋白，这些杂蛋白根据性质不同，可分为：可溶性杂蛋白、沉淀在 层析介质、疏水性蛋白、脂蛋白或脂类。参见下列内容：不同类型的杂蛋白的在位清洗程序。 1.1 可溶性杂蛋白的清洗方法 a. 凝胶过滤介质：一般使用 0.1-0.5 M 的 NaOH 清洗 0.5-1 个 (CV) 柱床体积；然后超纯水 1-2 CV b. 离子交换介质：2 M NaCl 清洗 0.5 CV；或至少接触 10-15 min c. 疏水层析介质：超纯水 (低离子强度的缓冲液) 清洗 2-3 个 CV，或使用 30%异丙醇清洗 2-3 个 CV d. 亲和层析介质：根据层析介质的性质使用适当的缓冲液清洗可溶性杂蛋白 热线电话：800-810-9118；400-810-9118 GE Healthcare ?KTA Club 1.2 沉淀蛋白的清洗方法 a. 一般层析介质 (GF/IEX/HIC) 的方法：0.5-1 M NaOH 清洗 3-4 个 CV，然后使用超纯水冲洗 pH 至中性 b. 亲和层析介质：一般使用尿素或盐酸胍清洗 1-2 个 CV 1.3 疏水性杂蛋白或脂蛋白的清洗方法 a. 一般层析介质 (GF/IEX/HIC) 的方法：0.5-1 M NaOH 清洗 3-4 个 CV，然后使用超纯水冲洗 pH 至中性 b. 亲和层析介质：一般使用尿素或盐酸胍清洗 1-2 个 CV 1.4 脂类杂质的清洗方法 a. 0.5%的非离子去污剂清洗 3-4 个 CV，对于吸附较 强的脂类可以优化 70%的乙醇或 30%的异丙醇清洗 2．内毒素的去除 内毒素是生物制药工艺生产中必须去除的物质， NaOH 对内毒素有较好的去除效果，在内毒素的去除 试验中 0.5-1.0 MNaOH 的浓度作用 4-6 h 会有较好的 效果。但是在实际的生产中，如果是连续生产中的 CIP 时，一般使用 0.1-0.5 M NaOH 接触 15-30 min 或 清洗 1 个 CV 就可完成去除残余内毒素以及层析介质 的消毒工作。对于已经保存了一段时间的层析介质， 一般需要较长的时间，做去除内毒素与消毒工作。右 图所示为不同浓度的 NaOH 去除内毒素所需的时间 (去除前溶液内毒素浓度 100 ng/ml)。在内毒素挑战试 验中 (Bioprocess 系统＋BPG 层析柱＋Q Sepharose 图：不同浓度的NaOH 对内毒素的去除作用 Fast Flow)，上样中含 1200EU/ml 的内毒素，室温 23 h 保存。使用 1 M NaOH 去除系统中的内 毒素，然后使用无菌水冲洗至 pH 中性。检测 TOC 以及 LAL。证明 1 M NaOH 处理 1 小时后可 以对系统的内毒素 完全去除。 3．核酸： 核酸带负电，与阴离子交换吸附较强，实践证明 1 M NaOH+