实验1PCR扩增基因.docVIP

实验一 PCR扩增基因 【实验目的】通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。 【实验原理】 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是一种选择性体外扩增DNA的方法，其基本原理类似于DNA的天然复制过程。 它包括: 变性(Denature) 、 退火(Anneal)和延伸(Extension)三个基本步骤。这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA扩增达106 倍。 利用PCR技术可在短时间内获得数百万个特异的DNA序列的拷贝。PCR技术在分子克隆、遗传病的基因诊断等方面得到广泛的应用。 PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。 PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。 PCR反应包括三个基本步骤变性、退火和延伸。 Step1. 变性：加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。 Step2. 退火：溶液温度降至50～60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。 Step3. 延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链为模板，利用引物的3’-OH，以反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）为底物，按5’－3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。 PCR反应混合物的组成： 典型的PCR反应体系由如下组分组成： 反应缓冲液(Buffer) dNTP(dATP,dCTP, dGTP and dTTP) MgCl2 两个DNA引物 DNA模板 耐热Taq聚合酶 PCR的特点 灵敏度高 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 病毒检测的灵敏度可达3个RFU 细菌检测的最小检出率为3个细菌 简便、快速 一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 扩增产物一般用电泳分析 对标本的纯度要求低 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组等组织的粗提DNA 【仪器耗材与试剂】 （一）仪器与耗材 1. PCR热循环仪 2. 琼脂糖凝胶电泳系统 3. 吸头、离心管 （二）试剂 1. 10×PCR Buffer 2. dNTP （ 其中包括dATP、dCTP、dGTP与dTTP；每种浓度均为2.5 mmol/L ） 3. M13 Forward 和Reverse引物（10 μM） 4. DNA模板 （质粒DNA，100 ng/μL ） 5. Taq DNA聚合酶（5 U/μL） 【实验步骤】 1. 在0.2 mL Eppendorff管内配置25 μL反应体系： 反应物 体积（μL） dd H2O 17.2 PCR缓冲液 （10×） 2.5 dNTP （10 mmol/L ） 2 引物1 1 引物2 1 模板DNA 1 Taq DNA聚合酶 0.3 2. 按下述程序进行PCR扩增: 1） 94℃ 预变性 3 min； 2） 94℃ 变性 30 sec 3） 55℃ 退火 45 sec； 4） 72℃ 延伸 1 min ； 5） 重复步骤2~4, 29次； 6） 72℃ 延伸 10 min； 7） End. 3. 琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果 配制1％琼脂糖凝胶，取10 μL扩增产物电泳。保持电压100V。电泳结束后，在紫外灯下观察结果。 【思考题】 1、影响PCR反应效率的因素有哪些？ 2、如何有效地提高PCR反应的效率？ 实验中要注意的问题 1. 微量移液器的正确使用。量程的选择、吸取和推出液体试剂时的注意事项、吸取液体试剂时简单目测试剂的量、如何有效减少误差、每次吸取试剂后更换吸头。 2、试剂的充分混合 3、良好的秩序 实验 二 质粒DNA及其酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测 一、琼脂糖凝胶电泳 试剂： 1 ×TAE电泳缓冲液 琼脂糖 10×电泳加样缓冲液 溴化乙锭（EB） 1.制备凝胶 制备琼脂糖凝胶（1%） 1×TAE 50ml 琼脂糖 0.5g 放入50ml的锥形瓶中，加热溶化后再加入 溴化乙锭（EB）至总浓度为1 ?g /ml 灌入水平胶框，插入梳子，自然冷却。 凝胶在室温下放置30min，使其自然凝结，小心拔出梳子。 将凝胶放入电泳槽中，向电泳槽中加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶约1mm