脉冲场凝胶电泳的原理概要.pptVIP

脉冲场凝胶电泳的原理及相关注意事项 普通凝胶电泳 通常的琼脂糖凝胶电泳利用双链DNA 分子在电场作用下，在凝胶中的迁移率不同而达到分离的目的。 当双链DNA 分子超过一定的大小以后，DNA 双螺旋的半径超过了凝胶的孔径，在琼脂糖中的电泳速度会达到极限，此时凝胶不能按照分子大小来筛分 DNA。 脉冲场凝胶电泳 (Pulsed Field Gel Electrophoresis ,PFGE) 用于分离大分子量DNA 片段的一种电泳方法。 PFGE 是通过脉冲电场方向、时间与电流大小交替改变完成分离大分子DNA。 影响PFGE的因素 琼脂糖凝胶浓度 浓度越高，移动速度越慢，适合分离低分子量DNA 浓度越低，移动速度越快，适合分离高分子量DNA 1%的琼脂糖浓度最大可以分离3Mb的DNA片段 1.2–1.5%的琼脂糖浓度可以使片段更加紧密 0.5-0.9%的琼脂糖浓度可以分离片段更大的DNA片段， 不过条带很弥散 缓冲液和温度 温度越高，DNA移动速度越快，但是条带的清晰度和分辨力明显下降。温度过高会导致DNA带变形或解链。 最佳电泳温度是14 ℃ 最常用的电泳液是 0.5x的TBE buffer，有时也可以用1.0x的TAE buffer代替 脉冲时间 当电场方向发生改变, 大分子的DNA 便滞留在胶孔中, 直至沿新的电场重新定向后, 才能继续向前移动,大分子DNA 重新定向需要的时间长 当DNA分子变换方向的时间小于脉冲周期时,DNA 就可以按其分子量大小分开 电压 最常用的电压是6V/cm，低电压时，迁移率与电压成正比，想分离大分子DNA时一般选用低电压和延长脉冲时间 脉冲角度 随着角度的减小，较大的片段分离的更好，较小的片段分离的效果降低。 注意事项 蠕动泵的流速：电泳过程中，控制好蠕动泵的流速，一般控制在50-70左右，以免速度太快，使胶在溶液中移动。 冷却泵的开启：冷却泵开启时，一定要把蠕动泵打开，以避免冷却泵管道内的溶液因为过度制冷，凝结成冰块而堵塞管道。 电泳结束后，应及时取出凝胶，进行染色等操作，以避免因为时间太长，而造成条带的弥散。 可能遇到的问题以及解决方法 凝胶在缓冲液中漂浮---蠕动泵的速度太快或太慢，请调到合适的速度。 缓冲液不流动或流速慢---检查冷却泵：当冷却泵制冷时，如果蠕动泵没有开，会造成管道内结冰，导致管道堵塞。 电泳条带扭曲---因为流速太低，导致制冷不充分，或不均一 、缓冲液体积必须大于2.2 L 条带变粗 ---减少上样量 条带拖尾或模糊---电场转换时间不适合，优化电场转换时间、上样量太高，调整样品浓度 大片段DNA 不能有效分离---降低电压、延长电场转换时间 条带弯曲---缓冲液缓冲能力下降，更换缓冲液、上样时样品块被挤碎、泵速度太慢 * * 分离不同大小DNA 改变脉冲时间 *