第43讲生物化学与分子生物学技术实践.doc

第43讲　生物化学与分子生物学技术实践 [考纲要求]　1.蛋白质的提取和分离。2.PCR技术的基本操作和应用。3.从生物材料中提取某些特定的成分。 考点一　生物技术实践——蛋白质的分离与纯化 1．纯化原理 蛋白质之间以及蛋白质与其他物质之间在分子大小、溶解度、所带电荷的多少、吸附性质等方面存在差异。 2．纯化方法 (1)透析法 ①原理：蛋白质水溶液具有亲水胶体溶液性质，不能透过半透膜。 ②目的：去除小分子化合物杂质，如无机盐、单糖、双糖、氨基酸等。 ③常用的半透膜：肠衣、玻璃纸。 ④步骤：将待纯化的蛋白质溶液装入透析袋内，再把透析袋放入透析液中即可。 (2)离心法 ①原理：在离心力的作用下，分子大小、密度不同的分子沉降速度不同，从而被分离。 ②目的：使分子大小、密度不同的不同种类的蛋白质彼此分离。 (3)电泳 ①概念：带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动的现象。 ②原理：不同的物质所带电荷不同，颗粒的大小、形状不同，因此，在电场中的泳动速度不同。 ③影响泳动的因素：带电颗粒的性质，即颗粒的大小、形状和所带净电荷的多少；此外还有电场强度、溶液的pH等因素。 ④泳动特点：带电颗粒直径越小，越接近于球形，所带净电荷越多，则在电场中的泳动速度越快；反之，则越慢。 ⑤支持物：滤纸、醋酸纤维薄膜、大分子凝胶等。 易错警示　(1)注意：透析时间为12 h。透析袋是用硝酸纤维素制成，小分子可自由进出，而大分子保留在袋内。 (2)关键步骤及其技术要求：点样是本实验的关键步骤。点样前，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散；但不易太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始参差不齐，影响分离效果。 1．仔细观察下图，所带负电荷少的球蛋白是(　　) A．α1-球蛋白 B．α2-球蛋白 C．β-球蛋白 D．γ-球蛋白 答案　D 解析　对于几种球蛋白来说直径相差不大，引起泳动速度的差异主要来自于所带电荷多少，由图可知球蛋白由右向左泳动，因右侧为负极，且γ-球蛋白距点样处最近，所以γ-球蛋白所带负电荷最少。 1．透析 (1)过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12h。 (2)图示： 2．血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 (1)血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳流程 (2)结果及其分析 ①结果 ②结果分析 从电泳图谱示意图中可以看出：a.血清蛋白主要包括五种蛋白质，且含量最多的是清蛋白，其他依次是：γ-球蛋白α1-球蛋白α2-球蛋白β-球蛋白； 由五种蛋白质所处的位置可判断出它们均带有负电荷，且四种球蛋白的电量大小依次为：α1-球蛋白α2-球蛋白β-球蛋白γ-球蛋白。 考点二　从生物材料中提取某些特定成分 1．植物芳香油的基本知识 (1)成分：组成较复杂，主要包括萜类化合物及其衍生物。 (2)特点：具有很强的挥发性，易溶于有机溶剂。 (3)应用：玫瑰精油是制作高级香水的主要成分，能使人产生愉悦感；橘皮精油的主要成分是柠檬烯，具诱人的橘香味，是食品、化妆品和香水配料的优质原料。 2．橘皮精油的提取流程与关键 石灰水浸泡→漂洗→压榨→过滤→静置→再次过滤→橘皮精油 (1)橘皮的处理：干燥后一定要用石灰水浸透，时间至少10 h以上。 (2)压榨液的处理：可以先用普通布袋过滤除去固体物和残渣，然后离心进一步除去质量较小的残留固体物，再用分液漏斗或吸管将上层的橘皮精油分离出来。 易错警示　(1)植物芳香油的提取方法主要有水蒸气蒸馏法、压榨法、萃取法。水蒸气蒸馏是植物芳香油提取的常用方法，但会导致原料焦糊或有效成分水解等，若植物有效成分易水解，则不宜采用此法。玫瑰精油、橘皮精油、胡萝卜素的提取分别采用水蒸气蒸馏法、压榨法、萃取法。 (2)水蒸气蒸馏可用明火加热，萃取过程应该避免明火加热，采取水浴加热，这是因为有机溶剂都是易燃物，直接用明火加热容易引起燃烧、爆炸。 (3)用于萃取的有机溶剂必须事先精制，除去杂质，否则会影响芳香油的质量。 (4)在用水蒸气蒸馏法制取玫瑰精油时，玫瑰乳浊液提纯过程中油水混合物中要加入氯化钠的目的是增大盐水的密度，有利于玫瑰精油与水的分层。加入无水Na2SO4的目的是吸收精油中残留的水分。 (5)橘皮精油的提取过程中，橘皮洗净晾干后，要浸泡在pH大于12、质量分数为7%～8%的石灰水中16～24 h，其目的是防止橘皮压榨时滑脱，提高出油率。 2．请回答下列与实验室提取芳香油有关的问题： (1)植物芳香油的提取可采用的方法有压榨法、 和 。 (2)芳香油溶解性的特点是难溶于 ，易溶于 ，因此可用 作为提取剂来提取芳香油。 (3)橘