江苏省肿瘤医院乳腺科.ppt

◆ 研究目的和意义 ■目的：研究亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因 C677T、A1298C多态与乳腺癌患者对新辅助 化疗敏感性的关系。 ■意义：寻找可靠的预测指标指导个体化治疗, 从而 为进一步实现乳腺癌规范化综合治疗提供参 考依据。 ◆ 研究对象 ◆ 评定标准 ▲ 化疗疗效的评定标准： 参照WHO实体瘤疗效评定标准 分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、无变化(SD)和进展(PD)。 ▲ 化疗后病理反应分级标准 ◆ 实验技术路线 §试剂: 4×dNTPs（宝生物工程(大连)有限公司)) 引物（宝生物工程(大连)有限公司) Taq 酶(北京博瑞科技有限公司) 限制性内切酶Hinf I(宝生物工程(大连)有限公司) 10×Buffer(宝生物工程(大连)有限公司) §仪器: PCR 扩增仪两台(美国MJ公司，德国Biometra公司) 冷冻高速离心机(0～16000r/min) (德国Eppendorf公司) 可调式移液器(0～2μl, 0～100μl, 0～1000μl)(GILSON公司) PCR扩增MTHFR 677基因片段 (198bp) MTHFR 677基因型检测 （Hinf I酶切PCR扩增产物） 结果判断 ● 结果判断 1）当为677C/C基因型时， PCR产物不能被限制性内切酶Hinf I 酶所识别，PCR产物则不能被消化，琼脂糖凝胶上表现为198bp片段，可清晰见到198bp一条亮带。 2）当为677T/T基因型时，PCR产物被限制性内切酶Hinf I酶消化后可产生175bp、23bp二个新的片段。其中23 bp的片段由于太短而无法在凝胶上清楚的显示，故琼脂糖凝胶上只可清晰的见到175bp一条亮带。 3）当为677C/T基因型时，可产生198bp、175bp、和23bp三个片段。其中23bp的片段由于太短而在凝胶上无法清楚显示，故琼脂糖凝胶上只清晰见到198bp和175bp两条亮带。 ● Hinf I酶切MTHFR 677基因DNA  片段产物电泳图 ▲ MTHFR A1298C基因多态性检测方法 §试剂: 4×dNTPs（宝生物工程(大连)有限公司)) 引物（宝生物工程(大连)有限公司) Taq 酶(北京博瑞科技有限公司) 限制性内切酶Mbo Ⅱ（宝生物工程(大连)有限公司) 10×Buffer(宝生物工程(大连)有限公司) §仪器: PCR 扩增仪两台(美国MJ公司，德国Biometra公司) 冷冻高速离心机(0～16000r/min) (德国Eppendorf公司) 可调式移液器(0～2μl, 0～100μl, 0～1000μl)(GILSON公司) PCR扩增MTHFR A1298C基因片段 (84bp) MTHFR A1298C基因型检测 （MboⅡ酶切PCR扩增产物） 结果判断 ▲ 结果判断 1）当为1298A/A基因型时，PCR产物被限制性内切酶Mbo Ⅱ消化后可产生56bp、28bp二个新的片段。其中28bp的片段由于太短而在凝胶上无法清楚显示，故琼脂糖凝胶上只可清晰见到56bp一条亮带。 2）当为1298A/C基因型时，可产生84bp、56bp、和28bp三个片段。其中28bp的片段由于太短而在凝胶上无法清楚显示，故琼脂糖凝胶上只可清晰见到84bp和56bp两条亮带。 ▲ Mbo Ⅱ酶切MTHFR A1298C基因 DNA片段产物电泳图 ● MTHFR基因型和新辅助化疗疗效的关系(表1） ● MTHFR基因型与乳腺癌新辅助化疗病理反应率 的关系（表2） 一.MTHFR基因多态