大肠杆菌基因工程分解.ppt

DNA体内重组的基本原理 同源序列依赖型的体内重组：同源交换 * ori 目的基因 同源区域 标记基因 交换区域 染色体DNA ori 标记基因 + 蛋白酶抗性 / 缺陷型表达系统的构建 稳定性：无论在真核生物，还是在原核细胞中，重组目的蛋白都可能被降解，其稳定性常常不如半衰期较短的内源性蛋白质。 不稳定性根源：对受体细胞蛋白酶系统的敏感性。 解决：通过蛋白序列的人工设计 受体细胞的改造 * 蛋白酶缺陷型受体细胞的改造 lon基因缺陷的大肠杆菌受体（lon -）： 大多数不稳定的重组目的蛋白被大肠杆菌中的蛋白酶La和Ti降解，分别由lon和clp基因编码，蛋白水解活性依赖于ATP lon基因由热休克等环境压力激活，细胞内异常蛋白或重组异源蛋白的过量表达也可作为一种环境压力诱导lon基因的表达。 lon -的大肠杆菌突变株可使半衰期较短的细菌调控蛋白（如SulA、RscA、lN）稳定性大增，被广泛用作外源基因高效表达的受体菌 * 蛋白酶缺陷型受体细胞的改造 htpR基因缺陷的大肠杆菌受体（htpR-）： 大肠杆菌中庞大的热休克蛋白家族：降解异常或异源蛋白，其机理是胁迫异常或异源蛋白形成一种对蛋白酶识别和降解较有利的空间构象，提高异常或异源蛋白对蛋白酶的敏感性。 热休克基因dnaK、dnaJ、groEL、grpE以及环境压力特异性s因子编码基因htpR的突变株均呈现出对异源蛋白降解作用的严重缺陷，特别是lon-htpR-的双缺陷株，非常适合高效表达各种不稳定的重组异源蛋白。 * 抗蛋白酶的重组异源蛋白序列的设计 多肽链C末端氨基酸序列对稳定性的影响 极性氨基酸，天门冬氨酸Asp对提高蛋白质稳定性的效应最显著，Asp残基离C末端越近，蛋白质的稳定性就越大 在多种结构和功能相互独立的蛋白质C末端引入Asp残基，能显著地延长蛋白质的半衰期 * 抗蛋白酶的重组异源蛋白序列的设计 多肽链N末端氨基酸序列对稳定性的影响： 多肽链的N末端序列中含有较高比例的Ala、Asn、Cys、Gln、His，蛋白质的稳定性显著改善。 N末端含有Pro、Glu、Ser、Thr的真核生物蛋白质，在真核和原核细胞中的半衰期通常很短，尤其Pro-Glu-Ser-Thr序列（PEST序列），是胞内蛋白酶的超敏感区 * 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制 改善基因工程菌不稳定性的策略 * 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制 工程菌遗传不稳定性的表现形式 主要表现在重组质粒的不稳定性，两种表现形式 结构不稳定性 重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表观生物学功能的丧失 分配不稳定性 整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸（curing） * 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制 工程菌遗传不稳定性的产生机制 受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解 外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢 能量、物质的匮乏、外源基因表达产物的毒性，诱导受体细胞产生应激反应：关闭合成途径，启动降解程序 重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 重组质粒逃逸的基本原因 受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排 * 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制 重组质粒的逃逸率 宏观逃逸率：含有重组质粒的工程菌在非选择性条件下生长时，培养系统中一部分细胞不再携带重组质粒，这些空载细胞数与总细胞数之比。 重组质粒逃逸的原因： 高温培养、表面活性剂（SDS）、药物（利福平）、染料（吖啶）促使重组质粒渗漏 受体细胞中的核酸酶降解重组质粒 重组质粒在受体细胞分裂时不均匀分配 拷贝数的差异随着细胞分裂次数的增多而加剧 * 改善基因工程菌不稳定性的策略 改进载体受体系统 施加选择压力 控制目的基因的过量表达 优化基因工程菌的培养工艺 * 改善基因工程菌不稳定性的策略 改进载体受体系统 以增大质粒稳定性为目的构建载体--受体系统： 将R1质粒上的parB基因引入表达型载体中，其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞 正确设置载体上的多克隆位点，禁止DNA片段插在稳定区内 将受体细胞的致死性基因安装在载体上，同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的ssb基因（DNA单链结合蛋白编码基因） * 改善基因工程菌不稳定性的策略 施加选择压力 根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素 药物和食品生产时禁止使用抗生素 根据载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份 培养基复杂，成本较高 * 改善基因工程菌不稳定性的策略 控制目的基因的过量表达 使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度 使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数 优化基因工程菌的培养工艺 培养基组成：限