08植物基因工程概论.ppt

（四）植物原生质体的再生程序 悬浮物离心除细胞碎片；将原生质体悬浮液滴在无菌滤纸片上，置于含有普通植物细胞（所谓的滋养细胞）的固体再生培养基，使原生质体与滋养细胞不直接接触，但可吸收由滋养细胞分泌扩散的植物生长因子及其它化合物； 将植物嫩叶、幼芽或愈伤组织切成碎片，浸入含有纤维素酶的缓冲液中保温； 标准的高等植物原生质体制备和再生程序是： 培养2-3周后，将滤纸上的植物细胞蔟转移至含有高浓度分裂素和低浓度生长素的固体培养基上继续培育2-4周，滤纸片上便长出嫩芽；将嫩芽置入含有低浓度生长素而无分裂素的固体培养基上，使其根部发育；大约3周后再将之移植在土壤中，长成整株植物。 植物原生质体的再生程序 第四节、转基因植物的基因鉴定 转基因植物的基因鉴定方法 1. 表型 2.选择压力-抗性基因 3.PCR 4. southern-blotting 5. northern-blotting 6. western-blotting 7.后代遗传分析 转基因植物的southern-blotting分子鉴定 （一）利用转基因技术研究基因的表达与调控 转报告基因研究植物基因的表达与调控 报告基因（reporter gene ）：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。 五、植物基因工程的应用 报告基因条件： (1)已被克隆和全序列已测定； (2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物； (3)其表达产物能进行定量测定。 转移DNA，编码冠瘿碱的合成，能随机整合到植物的染色体上。长度一般为12-24kb，是Ti质粒最重要的部分。 ①T-DNA（transfer-DNA） 左边界 右边界 生长素 基因 细胞分裂 素基因 冠瘿碱 合成 生长素基因: tms、tmr基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤; iaaM（tms1）和iaaH（tms2）控制由色氨酸产生生长素吲哚乙酸的生物合成途径. tmt 基因编码产物催化合成冠瘿碱(Opines)。冠瘿碱的代谢产物为氨基酸和糖类，是根癌农杆菌生长必需的物质，供根癌农杆菌作为营养使用。是农杆菌的碳源和氮源。大部分其他土壤微生物都不能利用冠瘿碱。 在T-DNA 的两端还含有左右2个边界，左边界(left border, LB)和右边界(right border, RB)是长为25bp的末端重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。 ②毒性基因（vir） 决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的转移， 进入和整合。使根癌农杆菌表现出毒性。 ③Con 区(regions encoding conjugations，接合转移编码区)：该区段上存在与细菌间接合转移的有关基因，调控Ti 质粒在农杆菌之间的转移。 ④Ori区(origin of replication，复制起始区)：Ori区上的基因调控Ti 质粒的自我复制。 ①第一步:植物受伤 植物受伤后能分泌酚类化合物（如乙酰丁香酮、?羟基乙酰丁香酮），诱导Ti质粒上的毒性基因表达。 (2). 农杆菌的感染和生存 ②第二步 感染植物 ?第三步 毒性基因（vir）表达 T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。 脓杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常在茎的基部）。 virA、virG、virD、virB ④第四步 T-DNA转移 T-DNA被vir基因产物切下来，并运送到植物细胞核里，整合到植物基因组中。 ⑤第五步 诱导冠瘿瘤 （6）第六步 土壤农杆菌代谢冠瘿碱。 裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子叶植物（玉米 ?能够自发地整合到植物的染色体上。 ?能转化多种植物。 ?强启动子 (3).Ti质粒转化的对象 (4). Ti质粒作为载体的可能性 T-DNA的opine合成酶基因上有一个强启动子，能启动外源基因的表达。 （5）T-DNA的染色体整合机制 ①野生型Ti 分子大（200kb）操作起来十分麻烦； ②各种限制型酶切位点多，切割产生很大片段。且单一的酶切位点很少； ③tms和tmr 基因产物干扰植物内源激素的平衡，产生冠瘿瘤，阻碍转基因植物细胞的分化和再生； ④冠瘿碱的合成过程消耗大量的精氨酸和谷氨 酸，直接影响转基因植物细胞的生长代谢； ⑤无大肠杆菌的复制起点和作为转化载体的选择标记基因。  (6). 天然Ti质粒作载体的缺点 （7）Ti 质粒的改造 除去生长素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因； 除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt）