细胞内自由钙离子浓度的测定方法.PDFVIP

细胞内自由钙离子浓度的测定方法 张春光　郑海雷　马建华　赵中秋 ( 厦门大学生命科学学院 福建厦门 361005) 　　钙离子不仅是植物生长发育所必需的 1 种大量元 光高峰发生迟缓, 比相应生理过程要慢。 素, 而且在植物的信号传导中起重要作用。钙离子作为 目前采用基因工程的方法, 改变钙水母荧光蛋白的 ( ) 一种第二信使把外源信号 激素、光、重力、温度等 转变 光谱性质和灵敏度, 并将克隆的钙水母荧光蛋白基因导 成胞内信号, 导致一系列胞内事件的发生。大量的研究 入烟草等植物细胞, 并在其中表达, 不仅成功解决了人 表明, Ca2+ 的信使功能是通过调控细胞内游离Ca2+ 浓 工注射的困难和对细胞的伤害问题, 还可进行植物整株 度来实现的。Ca2+ 信号的产生和终止是细胞内 Ca2+ 增 各部分细胞Ca2+ 测定, 而且也可以更加准确的定性、定 减、波动的结果。因此测定细胞溶质中的Ca2+ 浓度是十 量测定细胞内Ca2+ 浓度。 分重要的。 2　钙荧光指示剂 从理论上讲, 测定细胞内 Ca2+ 浓度的方法应符合 2. 1　钙荧光指示剂概述 如下要求: 首先, 所使用的Ca2+ 指示剂必须对Ca2+ 有很 钙荧光指示剂法是目前应用最广泛的, 也是较好的 强的专一性; 其次, 是灵敏度高, 能够测定低浓度的 测定胞内Ca2+ 浓度的方法。这种荧光指示剂对 Ca2+ 有 Ca2+ ; 第 3, 对 Ca2+ 水平改变的反应必须比细胞内 Ca2+ 高度选择性和高亲和力, 能够检测低浓度的Ca2+ , 并且 信号引起的相关生理反应快; 第 4, 不会破坏细胞内的 应答迅速。根据激发或发射光谱的特征, 可将它们分成 正常生理生化过程。 单波长荧光指示剂和双波长荧光指示剂。 Ca2+ 测定方法有金属铬指示剂法、偶氮胂指示剂 1982 年, 加利福尼亚大学的 T sien 等合成出了第 1 代 2+ 荧光指示剂, 包括 1、 2、 3。其中 法、微电极法、荧光蛋白指示剂法以及钙荧光指示剂法 Ca Q uin Q uin Q uin 等。下面主要介绍两种常用的方法: 荧光蛋白指示剂法 Q uin2 的准确度较高, 对钙的亲和力较高, 适于静态细 和钙荧光指示剂法。 胞钙的测定, 但具有对温度敏感、激发波长较短、光稳定 1　荧光蛋白指示剂 性差及离子选择性差等缺点, 并且所需的Q uin2 浓度 较高, 要达到 0. 5 才能高出背景荧光。 在 20 世纪 60 年代初, Sh imom ura 等从多管水母属 mmol L ( ) 中分离出 1 种钙水母荧光蛋白, 该蛋 1985 年, 第 2 代钙荧光指示剂出现, 包括 Fura1、 A equoria v ictoria 2+ 2、 3、 1, 其中 2 最好。 2 是典 白与Ca 结合后, 辅基被氧化并发出蓝光。这种蛋白对 Fura Fura Indo Fura Fura 生物体内 2+ 的微量变化很灵敏, 在 0. 1～ 10 型的双激发荧光指示剂, 与钙结合后导致荧光光谱移 Ca mol L 范围内, 荧光强度与Ca2+ 浓度成正比。 动, 当被 C