高级生物化学 8蛋白质的生物合成-张可伟.pptVIP

高级生物化学 8蛋白质的生物合成-张可伟.ppt

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基因载体 基因载体的条件;一、能自主复制或随受体细胞染色体DNA一起复制。二、易于鉴定和筛选。三、限制酶对其作用的切割点少。四、易引入受体细胞。 质粒--是细菌染色体外的小型环状双链DNA。 噬菌体和病毒--噬菌体是感染细菌的病毒。感染有两种方式,一种称为溶源性,另一种称为溶菌性。 Cloning Vector 基因工程的基本步骤 目的基因的获得 外源DNA与载体连接 重组DNA导入宿主细胞 重组体的筛选 克隆基因的表达、鉴定 基因工程的基本步骤 目的基因的获得 目的基因是指所要研究或应用的基因,或为了某种目的而感兴趣的DNA片段。 (一)DNA文库 包括基因组文库和cDNA文库 (二)获取目的基因的方法 1、DNA片段直接提取 2、从基因组文库和cDNA文库获取 3、用PCR技术扩增目的基因 4、用化学合成目的基因 外源DNA与载体连接 用连接酶将外源DNA与载体DNA通过共价连接,形成重组体。 重组DNA导入宿主细胞 转化:指质粒或其他外源DNA导入处于感受态的细菌细胞,并使其获得新的表型的过程。 转导:指感受态细胞捕获和表达噬菌体和病毒DNA分子的过程。 转染:是真核细胞主动或被动导入外源DNA片段而获得新表型的过程。 质粒连接转化 质粒转化 重组体的筛选 1. 插入失活法 2. 核酸杂交法 3. 免疫测定法 4. PCR扩增法 核酸杂交 13.2.5 克隆基因表达鉴定:蛋白质的原核表达纯化举例 蛋白质工程 (Protein Engineering) 蛋白质工程的概念 蛋白质工程是研究蛋白质的结构及结构与功能的关系,然后人为地设计一个新蛋白质,并按这个设计的蛋白质结构去改变其基因结构,从而产生新的蛋白质。 或者从蛋白质结构与功能的关系出发,定向地改造天然蛋白质的结构,特别是对功能基因的修饰,也可以制造新型的蛋白质。 (一)、基因定点突变是指将基因的某一个或某些位点进行人工替换或删除的过程。 (二)、蛋白质设计 依赖于蛋白质结构测定和分子模型的建立,按照蛋白质构效关系的理论基础,设计出比天然蛋白质性能优越的新型蛋白质。 定点 突 变 定点 突 变 13.3.2 蛋白质工程的一般技术 (一)、蛋白质工程的理论设计 活性设计:考虑被研究的蛋白质的功能,涉及选择化学基团及其空间取向。 专一性设计:指功能性蛋白质在发挥其生理功能的时,总是与其他分子发生专一性相互作用。 框架设计:是指对蛋白质分子的立体设计。 (二)、定点突变技术 通过删除或置换DNA片段中的核苷酸,使基因发生改变,从而产生新的蛋白质。 改变DNA核苷酸序列的几种方法: 1.基因的化学合成 2.基因直接修饰法 3.盒式突变技术 蛋白质工程实例 蛋白质工程的应用示例 (一)、蛋白质工程酶 1.改变酶的催化活性 2.改变酶的底物专一性 3.提高酶的稳定性 4.改变酶的反应特性 5.产生新酶 (二)、 药物研制 1. B-干扰素 2. 白细胞介素2 3. 胰岛素 尽管蛋白质工程的发展历史很短,但由于它在理论上对生命科学发展的贡献,以及商业上可能带来的巨大价值,使得它的发展异军突起,迅猛异常。总之,由于蛋白质工程能按人的意愿定向地改造蛋白质和酶,必然有着无限广阔的发展前景。 * UGA-sec, U UAG-pyl, O * * * 核蛋白体的大、小亚基分别有不同的功能: 小亚基:可与mRNA、GTP和起始tRNA结合, 沿5’ 3’方向移动. 大亚基: 有两个氨酰tRNA结合位点:受位(A位)氨酰基位,结合氨基酰- tRNA。给位(P位)肽酰基位,可与延伸中的肽酰基tRNA结合,成肽 具有肽酰转移酶活性:将给位上的肽酰基转移给受位上的氨基酰tRNA,形成肽键。 具有GTPase活性:水解GTP,获得能量 原核生物翻译过程中核蛋白体结构模式: A位:氨酰基位 (aminoacyl site) P位:肽酰基位 (peptidyl site) E位:排出位 (Exit site) (exit site) AUG ACA 5’ 蛋 苏 UGU GUU 3’ 受 位 (A位) 给 位 (P位) 大亚基 小亚基 蛋白质合成起始由起始因子催化,原核生物中,有三种起始因子(IF1 IF2 IF3),其作用主要是促进核糖体小亚基(30S)与fMet-tRNAifMet、模板mRNA及GTP结合形成30S起始复合物。 蛋白质合成的起始 IF3从30S起始复合体上脱落,50S大亚基与复合体结合,形成70S起始复合体。 GTP被水解,IF1和IF2从复合物上脱落。此时,tR

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