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Elabscience Tel: 86-27Fax: 86-27 Email: techsupport@ 免疫共沉淀实验指南 原理 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是利用抗原和抗体的特异性结合以及Protein A 或 G 特异性地结合到抗体的Fc 片段的现象探测两个蛋白分子间是否存在相互作用的一种方 法。在细胞裂解液中加入针对蛋白 M 的抗体，孵育后再加入 Protein A 或 G 预处理的 Sepharose 珠，若细胞中有与蛋白M 结合的蛋白N，就可以形成这样一种复合物：“蛋白 N-蛋白M—抗蛋白M 抗体—Protein A 或G—Sepharose 珠”，经SDS电泳分析检 测结果。这种方法得到的目的蛋白N 是在细胞内与蛋白M 天然结合的，符合体内实际情 况，得到的结果可信度高。这种方法常用于测定两种目标蛋白是否在体内结合；也可用于 确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 步骤 1. 用预冷的PBS 溶液洗涤贴壁细胞两次（对于悬浮细胞则用台式离心机以800-1000rpm 转速通过离心洗涤）。 6 2. 加入预冷的RIPA 液（含PMSF），RIPA 液的用量：按照0.5 mL 每5×10 细胞计算。 3. 用经蒸馏水预冷的橡皮或塑料细胞刮棒将贴壁细胞转移至一离心管中。 注：悬浮细胞，收集细胞沉淀后，加入预冷的RIPA 液（含PMSF），RIPA 液的用量： 6 按照0.5 mL 每5×10 细胞计算。轻轻混匀细胞悬液，用振荡器在4℃振荡15min 以 裂解细胞。 4. 于4 ℃，14000×g 离心裂解液15min，迅速转移上清至另一离心管中，弃掉沉淀。 5. 准备蛋白A （或蛋白G）-Sepharose：用PBS 洗涤蛋白A （或蛋白G ）-Sepharose 珠子两次，并将其用PBS 调制成50 ％悬液。 6. 每1mL 细胞裂解液上清加入100μL 蛋白A，4℃振荡10min，进行预清除。 7. 4 ℃，14000×g 离心10min 移去蛋白A （蛋白G 或Sepharose ）珠子，转移上清至一 新离心管中。 8. 用Bradford 法（考马斯亮蓝染色法）测定上清蛋白浓度。（应至少将细胞裂解液作1:10 稀释后再测定，这是因为存在于裂解液中的去污剂成分会干扰考马斯亮蓝的作用）。 9. 根据所测得的细胞裂解液蛋白浓度，用PBS 将其稀释至1mg/mL 以降低缓冲体系中去 污剂的浓度（但对于那些在细胞中表达水平较低的蛋白而言，10mg/mL 这样更高的浓 度可能对免疫沉淀更有效一些）。 10.加入推荐体积的免疫沉淀抗体至500μL 细胞裂解液中。（抗体的最适用量要根据每一 细胞模型中免疫沉淀靶蛋白的数量来确定）。 11.将细胞裂解液与抗体轻轻混匀后孵育2h ，或4℃ 振荡过夜。（选择孵育2h 常用于免 疫沉淀与激酶或磷酸酯酶作用的活化酶。）加入100μL 蛋白A （蛋白G 或Sepharose ） 轻轻振荡1h 或4℃过夜以捕获免疫沉淀复合物。 12.离心（14000 rpm，5s ）收集Sepharose 珠子，弃掉上清，用800μL 预冷的RIPA 缓 冲液洗涤珠子3 次。 ELABSCIENCE BIOTECHNOLOGY CO.,LTD FOR RESEARCH USE ONLY Elabscience 13.将Sepharose 珠子重悬于60μL 2 ×SDS 蛋白