细胞工程第五章课件.ppt

向军俭 向军俭 第五章 细胞融合与单克隆抗体技术 第一节 细胞融合 一、细胞融合的发展简史 二、细胞融合的基本技术 三、融合细胞的筛选 四、细胞融合的应用 五、融合细胞的克隆化 细胞融合是指在离体条件下用人工方法将不同种生物或同种生物的不同类型的细胞通过无性方式融合成一个细胞的技术。 二、细胞融合的基本技术 细胞虽在体外培养条件下会自发融合，但频率极低，故一般均须添加具有诱导细胞融合效应的生物或化学因子(融合剂)，或采用电融合技术，人为地促进细胞融合。 人们把这种可以促进细胞融合，提高融合率而加入的生物试剂或化学试剂叫作细胞融合剂。 1、细胞融合的机理 细胞融合实际上包含多个过程： 首先是两个亲本细胞并列，细胞膜接触，以后膜组织局部破坏，最终形成包围融合细胞的连续胞膜。 融合细胞表面的特征性变化，有膜成分和胞质成分交流以及细胞内电导率的连续性。 病毒融合剂(p82)： 最早被采用病毒融合剂有疱疹病毒、天花病毒和副粘液病毒等在内的病毒类融合剂。 灭活仙台病毒介导细胞融合过程可以大大提高融合频率。它在病毒类融合剂中最为有效，使用最广。 使用仙台病毒诱导细胞融合步骤 制备细胞悬液 紫外线灭活2分钟（使仙台病毒失去致病性，仅起融合因子的作用） 混合亲本细胞（高pH高Ca2+，加入灭活病毒8-10分钟） 杂种细胞的筛选 化学融合剂： ◆ 常用PEG ◆ 优点：融合成本低，不需特殊设备；融子合产生的异核率较高，融合过程不受物种限制 ◆ 缺点：可能会对细胞造成伤害 PEG诱导细胞融合的效果： 同其分子量大小及浓度高低相关。常用分子量为1000－6000，浓度为30－50％ 须严格掌握PEG的处理时间。 悬浮法，处理1－2分钟为宜。 离心法，先将细胞混合物悬于30－40％的PEG中，再通过离心进行融合，可适当延长接触时间，以5－8分钟为宜。随后，均须立即加液稀释，以及时终止PEG作用。 PEG溶液的pH7.4－8.0 电融合技术： 常用：细胞融合仪 电融合技术的原理： 1）细胞膜的接触（交流电） 2）细胞膜的击穿（直流电） 电融合技术的优点 ①不存在对细胞的毒害问题 ②融合效率高 ③融合技术操作简便 三、融合细胞的筛选 融合细胞的类型 1)两个完态细胞的融合:同核体、异核体 2）两个非完态细胞的融合：核质杂种、胞质杂种 1．药物抗性突变型的筛选 药物抗性突变型：细胞突变后对某一种药物的抗性显著增加而形成的一种突变型。 当把正常的野生型细胞培养在含有这一药物的培养基上，逐渐增加药物浓度，便可得到一条存活曲线（surival curve）。但是存在一些自发突变，这一细胞在药物的致死浓度中仍能生长。 糖 + 氨基酸 核 苷 从头合成途径 HAT选择培养基含: 次黄嘌呤(hypoxanthine) 氨基蝶呤（aminopterin） 胸腺嘧啶（thymidine） 氨基蝶呤可阻止从头合成途径的过程，所以细胞内HGPRT活性必须恢复，细胞才能存活。对于这类回复突变型的选择称为反向选择(reverse selection) 补救途径 从头合成途径 2．营养缺陷突变型的筛选 营养缺陷突变型是培养细胞突变型中的另一种重要突变类型。这些突变型表现在合成低分子量代谢物(如氨基酸，嘌呤、嘧啶等）的能力发生了改变，以致这些细胞所产生的生物量不能满足正常生长的需要。 营养缺陷型细胞是指，在一些营养物(如氨基酸、碳水化合物、嘌呤、嘧啶或其他代谢产物)的合成能力上出现缺陷，而难以在缺乏这些营养物的培养基中存活的变异型细胞。 例： 缺乏甘氨酸和脯氨酸的培养基上 3．温度敏感突变型的筛选 较高温度生长的细胞 4.荧光激活细胞分选仪（FACS）筛选 不同荧光标记的脂质染料分别标记两亲本细胞，融合细胞因发两种荧光而被筛选出来。 四、细胞融合的应用 1．淋巴细胞杂交瘤 2．基因定位 3．遗传基因的缺陷互补 4．分化功能的表达调控研究 5. 体细胞杂种的致癌性分析 6. 制作疫苗 7. 核移植和动物克隆 五、融合细胞的克隆化 1、克隆化的目的 1） 是细胞建株的必经过程，以得到遗传特征相同的细胞； 2） 就杂交瘤而言，可从中筛选出稳定而同源的杂种细胞系，淘汰遗传不稳定的杂交瘤细胞。 3） 减少非分泌型无关细胞生长过快。 2、饲养细胞的种类 对于培养小鼠细胞来说，主要有下列各种细胞可供作为其饲养细胞： ①胸腺细胞； ②正常的脾细胞； ③传代培养中的大鼠胚胎成纤维细胞； ④腹腔细胞，是使用得最普遍的饲养细胞。 3、克隆化培养方法