小陇山林区红豆杉愈伤组织诱导试验初探.docVIP

小陇山林区红豆杉愈伤组织诱导试验初探 　　摘要：介绍了小陇山林区的红豆杉形态特征及习性，并对红豆杉愈伤组织诱导进行了简要说明。 　　关键词：红豆杉；种子；愈伤组织 　　红豆杉（Taxus chinensis（Pilger）Rehd.）为红豆杉属常绿乔木或灌木，小枝不规则互生，基部有多数或少数宿存的芽鳞，稀全部脱落，冬芽芽鳞覆瓦状排列，背部纵脊明显或不明显。叶条形，螺旋状着生，基部扭转排成二列，直或镰状，下延生长，上面中脉隆起，下面有2条淡灰色、灰绿色或淡黄色的气孔带，叶内无树脂道。雌雄异株，球花单生叶腋；雄球花圆球形，有梗，基部具覆瓦状排列的苞片，雄蕊6～14枚，盾状，花药4～9，辐射排列；雌球花几无梗，基部有多数覆瓦状排列的苞片，上端2～3对苞片交叉对生，胚珠直立，单生于总花轴上部侧生短轴之顶端的苞腋，基部托以圆盘状的珠托，受精后珠托发育成肉质、杯状、红色的假种皮。种子坚果状，当年成熟，生于杯状肉质的假种皮中，稀生于近膜质盘状的种托（即未发育成肉质假种皮的珠托）之上，种脐明显，成熟时肉质假种皮红色，有短梗或几无梗，子叶2枚，发芽时出土。红豆杉属约11种，分布于北半球，我国有4种1变种。 　　小陇山林区位于亚热带向暖温带的过渡地带，自然条件优越、气候湿润、物种丰富，区内有许多珍稀濒危树种，如国内分布较少的红豆杉（Taxus）、连香树（Cereidiphyllum japon-icum Sieb）、金钱槭（D.sinensis）、庙台槭似（AceRm iaotaiens P.）等。红豆杉一般通过种子播种、组织培养、扦插繁殖，组织培养是利用植物细胞的全能性，用红豆杉植株的嫩茎、针叶、树皮、形成层、假种皮、胚等做为外植体进行培养研究。本试验以红豆杉的成熟种子、顶芽和茎段为材料，诱导愈伤组织的形成及萌发，为进一步研究快速繁殖红豆杉提供理论基础。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　以小陇山林区红豆杉树种的1年生枝萌发的嫩芽及种子作为外植体。 　　1.2方法 　　1.2.1诱导培养基。分别选用1/4MS、1/2MS、MS作为诱导培养基及继代生长培养基。培养基添加激素种类为NAP，（0.2～2.0）、GA（1.0）、KT（0.1～1.0），附加0.1%的活性炭，0.7%～0.896琼脂和3%的蔗糖，培养基pH值为5.8。 　　1.2.2接种。对带芽茎段和顶芽，先用洗涤剂清洗，自来水流水冲洗1～2h。再用0.1%的升汞溶液浸泡8～10min，之后用无菌水冲洗3～6次，在超净工作台中将幼茎切成1.0cm长的茎段，接入培养基中。 　　1.2.3种子处理。先将种子浸泡在30%温水中，作催芽处理（隔6h换1次水，浸泡约48h），将种子做剥皮与不剥种皮2种处理，泡在30%温水中。先用洗衣粉水冲洗，然后用洗涤剂清洗，自来水流水冲洗1～2h，再用0.1%的升汞溶液浸泡8～10min，最后用无菌水冲洗3～6次接入培养基。 　　1.2.4培养。将接种好的瓶苗置于培养箱中培养，培养温度为26℃，湿度50%～80%，暗培养1～2周后，开始光照时间12 h/d，光强2000～3000Lx。 　　2结果及分析 　　选取不同的外植体、不同的激素组合及不同浓度活性炭的MS培养基。在初培前3次转接后效果较好，愈伤组织紧凑，色绿而明亮有光泽，基部有少量的褐变现象；第4次转接愈伤组织疏松，有大量的褐化现象出现，呈水浸状，最后死亡。在第5、6次转接重新培养，生长状况良好，无褐化现象。试验表明，不同外植体种类、不同浓度的激素及其组合对红豆杉外植体愈伤组织诱导的影响较大。红豆杉顶芽外植体的污染率最低，基本无污染，产生愈伤组织的时间早，诱导率高，愈伤组织生长速度最快，这可能是由于芽的木质化程度低，细胞分裂旺盛的原因。而茎段污染率较高（约为25%），产生愈伤组织的时间较晚，诱导率低为10%～30%，愈伤组织生长速度较慢。茎段与顶芽诱导的最适培养基为MS和NAA、KT、GA激素的组合，均可产生愈伤组织，但顶芽诱导效果最好。 　　3结论 　　以当年生红豆杉树种的茎段、芽尖及种子作为外植体进行愈伤组织诱导试验，以MS培养基添加不同质量浓度的2，4-D、NAA、KT为培养基。结果表明：生长素与细胞分裂素的比例在10：1，2，4-D与NAP，的比例应在2：1，能有效促进细胞生长、缓解褐化，起始暗培养1～2周更有利于愈伤组织的诱导，诱导率高且诱导效果最佳。 　　红豆杉为木本裸子植物，由于其特殊的生物学特性，发生褐变的几率较高，即使培养出优良的愈伤组织进行继代或细胞悬浮培养时，不久亦发褐变，细胞随即停止生长甚至死亡，所以，解决褐化问题已是用细胞培养法进行木本植物组培快繁的瓶颈问题。本试验在组织诱导愈伤组织过程中同样出现了褐化现象，但不同浓度的激素及种类不同