突变型polβ启动子对其基因转录、翻译和顺铂敏感性的影响.docVIP

突变型polβ启动子对其基因转录、翻译和顺铂敏感性的影响 摘要： 目的：检测三种突变型polβ启动子对其基因转录活性、翻译水平及化疗药物顺铂敏感性的影响。 方法：分别将含人野生型（W）/ M和M突变型的polβ启动子pGL3-enhancer，与pRL-TK共转染入Eca9706、EC-1和KYSE30细胞，检测细胞的相对萤光素酶活性(relative luciferase activity, RLA)。分别W、M1、M2和M的polβ启动子与野生型polβ编码区cDNA，含人野生型/突变型启动子的polβ基因单元克隆入慢病毒表达载体，体外包装出病毒颗粒，分别感染polβ基因敲除的Eca9706细胞，筛选得到稳定整合的细胞株Eca9706-/--W、Eca9706-/--M1、Eca9706-/--M2、Eca9706-/--M3）。用荧光定量PCR和Westren-blot检测整合感染细胞株的polβ mRNA蛋白表达水平。整合感染细胞株polβ启动子突变型M1和M2的相对萤光素酶活性均显著高于野生型polβ启动子（P＜0.01) ； 而M3的相对萤光素酶活性与野生型polβ启动子的无显著差异（P＞0.05)。Eca9706-/--M1、Eca9706-/--M2细胞polβmRNA均显著高于Eca9706Eca9706-/--M1、Eca9706-/--M2细胞Eca9706-/--M3的polβmRNA、蛋白表达水平以及对化疗药物顺铂的敏感性与Eca9706-/--W均无显著差异（P＞0.05)。 结论：食管癌组织中的突变型polβ启动子（M1 -37位C→A，M2 -114位G→A -37位C→A）可显著上调DNA polβ基因的转录活性，使polβmRNA和蛋白表达水平升高DNA polβ；启动子食管癌已在结肠癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、前列腺癌等多种人类肿瘤组织中发现polβ的基因突变和／或异常 。po1β启动子突变存在[16]，启动子能启动基因转录，也是基因表达水平的重要调控环节po1β启动子突变和po1β高表达之间的关系仍然不清楚，因此本研究选取3个polβ启动子突变探讨分析突变型polβ启动子对基因polβ表达的影响：慢病毒包装细胞株293FT购自美国Invitrogen公司；人食管癌细胞株 (Eca9706)由中国医学科学院肿瘤研究所国家分子肿瘤重点实验室惠赠； DNA polβ基因敲除Eca9706细胞株Eca9706-/-）本实验室构建β启动子β启动子polβ启动子突变polβ启动子用QIAGEN公司基因组DNA小量提取试剂盒分别提取上述4个食管癌基因组DNA，Forward 5’ GCACTCGAGAAAGGATTCCAGATAAACACTG 3’和Reverse 5’ TATAAGCTTGGCGGCCTGCACCCGA GAACCC 3’为引物，分别扩增出M1、M2、M3和W 的DNA polβ核心启动子目的片段，经HindⅢXhoⅠ双酶切后分别重组入pGL3-enhancer，DNA测序鉴定得到pGL3-M1、pGL3-M2、pGL3-M3和pGL3-W。DNA polβ启动子萤光素酶活性的测定pGL3-M1、pGL3-M2、pGL3-M3和pGL3-W食管癌Eca9706LipofectamineTM2000将将重组质粒DNA（800ng）与海肾荧光质粒pRL-TK（80ng，作为内参）按照10：1的比例共转染入Eca9706、EC-1和KYSE30细胞，每组平行设立6个复孔。转染后37℃、5%CO2培养12h，换含10%胎牛血清的RPMI-1640继续培养24h后，使用promega公司Dual-Glo? Luciferase Assay System萤光素酶活性检测，记录各组转染细胞的相对萤光素酶活性(relative luciferase activity, RLA)。 2.5 含突变型/野生型启动子的polβ慢病毒表达载体构建DNA polβ核心启动子目的片段M1、M2、M3和Wpolβ OFR(结构基因)片段连接，然后将包含DNA polβ核心启动子polβ OFR的表达单元重组入慢病毒表达载体pLV5(删去启动子的慢病毒表达载体，上海吉玛公司)，DNA测序鉴定得到pM1polβ、pM2polβ、pM3polβ和ppolβ。ｘＴＭ、ＴＭ、和含突变型/野生型启动子的polβ慢病毒表达载体（pM1polβ、pM2polβ、pM3polβ和ppolβ）重组慢病毒感染polβ基因敲除的Eca9706细胞感染前1d取对数生长期状态良好的polβ基因敲除的Eca9706细胞按每孔5×104个细胞接种于24孔板中，感染时加入总体积300 μl， 含100 μl病毒液（MOI=10）及polybre