流式细胞术.ppt

488 nm 激光 + - 前向散射光 检测器 荧光检测器 电磁场 单个细胞被分类 进入检测管 流式细胞仪分选系统 三、流式细胞术的特点 速度快 对单个细胞或生物颗粒进行快速、逐个检测， 测量速度可以达到每秒数千个甚至上万个细胞 灵敏度高 每个细胞上只需带有1000～3000个荧光分子即能检测出来 多参数 多色荧光染色同时分析单个细胞或生物颗粒的多种特征 精度高 在细胞悬液中检测细胞，比其他技术的变异系数更小，分辨率更高 纯度高 可以把指定特征的细胞分选出来，分选细胞的纯度可达到99%以上 无害性 能保持细胞不被破坏，进行无害性定性或定量分析和分选 （一）影响因素 温度 pH值 非特异 荧光 固定剂 四、流式细胞术定量分析的注意事项 （二）质量控制 环境 要求 仪器 校正 样本 要求 设置 对照 数据的获 取和分析 确保标本上机检测前的浓度为1×106/ml，细胞浓度过低可直接影响检测结果。 封闭非特异性结合位点，尤其在间接免疫荧光标记时必不可少。 荧光抗体染色后需充分洗涤，注意混匀、低速离心，减少重叠细胞和细胞碎片。 注意避光染色，保证细胞免疫荧光的稳定。 设置对照样品，应采用与抗体来源同型匹配的无关对照和荧光抗体的本底对照。 判定结果时，应注意减去本底荧光，使免疫荧光的定量分析更准确。 （三）注意事项 第二节 FCM的关键技术 一、FCM单细胞标本的制备 流式细胞术的测定样本必须保证是单细胞悬液，这是进行流式细胞分析的最关键的第一步。 单细胞悬液大多来自生物样品，主要来源于培养细胞、血液、新鲜实体组织及石蜡包埋组织等，不同来源的样本制备单细胞悬液的方法也不同。 以某一类细胞群为检测对象，因此为了减少检测时的干扰因素，常常在测定前把某一细胞群（单核细胞或血小板）从血液分离出来，制成单细胞悬液再进行标记染色。 制备单个核细胞悬液的最常用方法是单次密度梯度离心法 （一）外周血单细胞悬液制备 （二）培养细胞的单细胞悬液制备 悬浮 生长 贴壁 生长 反复吹打 分散 细胞 常规 洗涤 低速 离心 蛋白酶消化 机械吹打 细胞 脱落 低速 离心 漂洗 重悬 单细胞 悬液 培养细胞一般是以悬浮或贴壁的方式生长 将新鲜实体组织进行单细胞悬液的制备是一项困难而复杂的技术。理想的状态是既要达到分离细胞的目的又要不损伤细胞。 最常用的方法是酶消化法、机械法、化学处理法和表面活性剂处理法等。 （三）新鲜实体组织单细胞悬液制备 该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应用范围，有利于进行临床回顾性研究和利用。 常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂脱蜡法和甲氧-双氧水处理法。 石蜡切片一般适宜厚度是40μm~50μm，脱蜡须彻底，获取组织后，用酶进行消化处理，消化时间不宜过长，以免细胞核被消化溶解，经过滤、漂洗后即可获得单细胞悬液。 （四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备 FCM主要的信号参数包括散射光信号和荧光信号，荧光染色是保证荧光信号产生的关键步骤。 目前间接免疫荧光染色已较少用；直接免疫荧光染色以双色以上分析较为常用。 单色免疫荧光多用于单克隆抗体特异性较高、单一细胞群的抗原检测，多色免疫表型分析宜采用同一品牌的试剂。 二、FCM样品的荧光染色 （一）FCM常见荧光染料的种类和特性 应有较高的量子产额和消光系数 对488nm波长的激发光有较强的吸收能力 发射光与激发光之间应有较大波长差 容易与被标记的单克隆抗体结合而不影响抗体自身的特异性。 理想的荧光染料需要具备： 常用荧光染料的特性和应用 荧光染料 激发光 (nm) 发射光 (nm) 颜色 应用 FITC 488 525 绿色 免疫荧光 PE（RDI） 488 575 橙色 免疫荧光 PE-Cy5 488 670 红色 免疫荧光 PE-Cy7 488 755 深红色 免疫荧光 ECD 488 620 橙红色 免疫荧光 PI 488 620 橙红色 DNA染色 APC 633 670 红色 1.直接免疫荧光染色法 优 点 操作简单，方法简便、快速 特异性强，与其他抗原交叉染色较少 反应中只有两种因素（细胞与抗体）参与，结果判断较简单 （二）FCM荧光染色的主要方法 一抗 二抗 2.间接免疫荧光染色法 优 点 敏感性高 具有更广的通用性 缺 点 ①操作步骤繁琐， 干扰因素较多 ②易产生非特异性染色， 结果判断有时比较困难 多色流式细胞仪的开发促进了新的荧光染料的合成及抗体标记物的发展。 多色标记简便、省时、节约成本，但对操作人员的要求较高。 试剂的选择还需结合仪器的配置考虑。 3.多参数分析时荧光抗体的组合标记 自发荧光：未经荧光标记的细胞受到激光照射后所