第三章基因工程制药.ppt

转录RNA为DNA的酶（ ） 能降解单链DNA和RNA ，打开cDNA双链的发卡结构（ ） 连接3’ 羟基 5’磷酸游离端（ ） 催化一个单核苷酸转移到一个DNA分子的3’羟基末端（ ） 逆转录酶 核酸酶S1 T4DNA连接酶 末端脱氧核苷酰转移酶 获得目的基因的方法（ ）和（ ） 蛋白质保存在稳定的pH下， pH是指（ ）pI。 目前使用最广泛的制备基因工程药物的宿主菌是（ ）和（ ）。 逆转录法 化学合成法 接近 大肠杆菌 酿酒酵母 当菌体生长所需能量（ ）菌体有氧代谢提供的能量时，菌体会产生乙酸， 高密度发酵：指培养液中工程菌的菌体浓度在（ ）以上， 包含体的复性过程中，（ ）蛋白浓度可以减少中间体形成提高复性率。 大于 50gDCW/L 降低 第十三节　基因工程药物制造实例 干扰素是真核细胞对各种刺激作出反应而自然形成的一组复杂的蛋白质。 干扰素除具有广谱抗病毒活性，还具有抑制细胞分裂，特别是抑制肿瘤细胞生长和免疫调节等功能，作为一种生物活性蛋白有着良好的临床应用价值。 干扰素是人体防御系统的重要组成部分。根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、γ、ω等4个类型。α型干扰素在分为α1b、α2a、α2b等亚型，其区别仅表现为个别氨基酸。 是我国已经批准上市的基因工程药物。 早期获得方法：用病毒诱导人白血球(白细胞)产生，产量低，价格贵。300L人血才提取1mg 。 2003年抗非典期间，江南大学与丽珠集团苏州新宝制药厂合作攻关，通过发酵工程和生物制药工程研制成功了重组人α-2b干扰素口鼻腔喷雾剂，解决了干扰素常温保存稳定性问题。在疫区特殊人群捐赠使用，效果显著。 一、基因工程菌的组建 诱生的白细胞 提取全RNA 通过寡dT-纤维素柱 蔗糖密度梯度 获得寡A的mRNA 离心提取12s 的 mRNA 逆转录成cDNA 双链cDNA接上dT或dG尾 pBR322质粒 pBR322质粒加上dA或dC 退火获的杂交质粒 转化大肠杆菌k12 扩增杂交质粒 筛选抗四环素但对氨苄 用已知干扰素的DNA片断作为 青霉素敏感细菌克隆 探针挑选富有干扰素cDNA克隆 将干扰素cDNA克隆入表达载体 在大肠杆菌 中进行高效表达 二、基因工程干扰素的制备 启开种子 制备种子液 发酵培养 粗提 精提 半成品制备 半成品检定 分装 冻干 成品检定 成品包装 α2b干扰素生产过程 1.发酵 工程菌：SW-IFNα-2b/E.coli DH5α，质粒用PL启动子，含氨苄青霉素抗性基因。种子培养基含1%蛋白胨0.5%酵母提取物0.5%NaCl。制备种子液作为发酵罐种子使用。 发酵培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，0.05%NaCl，0.01%NH4Cl等。发酵培养基加入氨苄青霉素，防泡剂。30℃发酵8h，然后在42℃诱导2-3h可完成发酵。每隔不同的时间取发酵液，离心称量湿菌体。 2.产品的提取与纯化 a冷却后离心，除上清液，得湿菌体悬浮于缓冲液中，冰浴条件下超声破碎； b离心，取沉淀部分；加尿素、缓冲液和二巯基苏糖醇溶液溶解。搅拌抽提2h，离心取上清。 c加入复性缓冲液，离心，除去不溶物。 d超滤器浓缩后，经Sephadex G50 分离。 e经SDS检查。 f再经DE-52柱纯化。 三、质量控制标准和要求 ⒈半成品检定 ⑴干扰素效价测定 ⑵蛋白质含量测定 ⑶比活性 ⑷纯度测定 ⑸相对分子量测定 ⑹残余外源性DNA含量测定 ⑺残余血清IgG含量测定 ⑻残余抗生素活性测定 ⑼紫外光谱扫描 ⑽肽图测定 ⑾等电点测定 ⑿除菌半成品应做