生物化学王镜岩第三版.ppt

第三章 蛋白质 第一节　氨基酸蛋白质的构件分子 第二节 蛋白质概述 第三节 蛋白质的共价结构 第四节 蛋白质的三维结构 第五节 蛋白质结构与功能的关系 第六节 蛋白质的性质和分离、纯化 第六节 蛋白质的性质和分离、纯化 一、蛋白质的性质 二、蛋白质相对分子质量的测定 三、蛋白质的分离纯化 四、蛋白质的含量测定与纯度鉴定 一、蛋白质的性质 （一）酸碱性质 （二）胶体性质 （三）沉淀作用 （四）变性作用与复性作用 （五）蛋白质的颜色反应 （六）蛋白质的紫外吸收 （一）酸碱性质 1.两性电解质： 2.蛋白质的等电点 3.蛋白质等离子点： 在没有其他盐类干扰的条件下，蛋白质解离的质子等于结合的质子时的pH，就是等离子点。 （二）蛋白质的胶体性质　 1.蛋白质溶液是胶体溶液 2.维持蛋白质的胶体系统稳定的因素 ①动力学上是稳定的. ②某一pH下质点带有同种电荷，互相排斥。 ③质点能与溶剂（水）形成水化层。 （三）蛋白质的沉淀 （四）蛋白质的变性与复性　 1.蛋白质变性作用：天然蛋白质受到外界各种理化因素的影响后，使其维系空间结构的次级键受到破坏，引起天然构象改变，从而使其理化性质和生物活性改变或丧失，这种作用称为蛋白质的变性作用。 2.导致蛋白质变性的因素 物理因素：有高温、高压、超声波、剧烈振荡、X射线和紫外线等； 化学因素：强酸强碱、尿素、去污剂、胍、重金属盐（Hg2＋、Ag+）等。 3.变性蛋白质的特点 ①生物活性丧失： ②某些物理化学性质改变： （五）蛋白质的颜色反应 1.双缩脲反应 双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成粉红色的复合物。 含有两个或两个以上肽键的化合物，能发生同样的反应（紫红色、蓝紫色） 。 受蛋白质特异性影响小。 此反应可用于定性鉴定，也可在540nm比色，定量测定蛋白含量 2.米伦氏反应 酪氨酸的显色反应（酚羟基反应） 米伦试剂为硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物 蛋白溶液中，加入米伦试剂，产生白色沉淀，加热后变成红色 3.坂口反应 精氨酸的反应（胍基的反应） 精氨酸与α-萘酚在碱性次氯酸钠（或次溴酸钠）溶液中发生反应，产生红色产物 鉴定蛋白质中是否含有精氨酸 定量测定精氨酸 4.乙醛酸反应 在蛋白质溶液中加入HCOCOOH，将浓硫酸沿管壁缓慢加入，不使相混，在液面交界处，即有紫色环形成。 色氨酸的反应（吲哚环的反应） 鉴定蛋白质中是否含有色氨酸 5.福林试剂反应（酚试剂反应） Tyr、Trp的反应 福林试剂：磷钼酸-磷钨酸 Lowry法测定蛋白浓度 在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反应 蛋白质-铜络合物，将福林试剂还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝混合物 500nm比色，灵敏度比双缩脲反应提高100倍 6.黄蛋白反应 浓硝酸与酪氨酸、色氨酸等苯环氨基酸的反应 生成黄色化合物 7.茚三酮反应 8.考马斯亮蓝G-250 本身为红色，与蛋白质反应呈蓝色 用于蛋白浓度的测定，灵敏度高 Bradford法 （六）蛋白质的紫外吸收 大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。 利用紫外吸收法测定蛋白质浓度。 二、蛋白质相对分子质量的测定　 1.根据化学组成测定最低相对分子质量 2.沉降分析法（超速离心法） 3.凝胶过滤法测定相对分子质量（分子筛层析） 4.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量 1.根据化学组成测定最低相对分子质量 例1：肌红蛋白和血红蛋白含铁量均为0.335%,计算二者的最低相对分子质量。 2.沉降分析法（超速离心法）　 1.沉降速度法 沉降系数:溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，用S表示（1×10-13秒）。相对分子质量越大，S值越大。 根据Svedberg方程计算蛋白质分子的相对分子质量 2.沉降平衡法 不需要扩散系数，且离心速度较低 要达到平衡常常需要几天时间。 3.凝胶过滤法测定相对分子质量（分子筛层析） 凝胶过滤的介质：多孔网状凝胶珠。 一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外。 经常使用的凝胶： 交联葡聚糖 聚丙烯酰胺和琼脂糖 三、蛋白质的分离纯化　　 （一）分离原理与程序 （二）蛋白质的分离纯化方法 （一）分离原理与程序 原理：利用欲分离蛋白质的溶解度、分子大小、电荷、对配体分子的特殊的亲和力、吸附性质，从混杂蛋白质中分离出一个特殊蛋白质。 （二）蛋白质的分离纯化方法　 1.根据分子大小不同的纯化方法 2.利用溶解度差别的纯化方法 3.根据电荷不同的纯化方法 4.利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法 5 利用吸附性质 1.根据分子大小不同的纯化方法　 ①透析和超过滤 ②密度梯度（区带）离心 每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，在离心管中被分离成各自独立的区带。