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PCR方法简介 王媛媛 PCR概念 PCR即聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction），是利用单链寡核苷酸引物对特定DNA片段进行体外快速扩增的一种方法。 PCR原理 PCR反应类似于DNA的天然复制过程，由三个循环的步骤构成： 模板DNA的变性 模板DNA与引物的退火(复性) 引物的延伸 PCR原理图解 1st cycle 2nd cycle 3rd cycle 过 程 变性 引物退火 DNA 延伸 PCR反应体系 DNA模板 Primer 1 Primer 2 DNA聚合酶 dNTPs PCR buffer ddH2O PCR体系对反应物的要求 引物 引物设计的一般原则 长度：一般20—30nt，应大于16nt。 碱基分布：随机或均匀分布，避免嘌呤或嘧啶的连续排列。 碱基组成：GC含量在45%—55%之间。 二级结构：应避免引物二聚体和发夹结构。 碱基配对：引物与模配对，3′端完全配对，5′端可不配对，故可设计酶切位点或其他需引进的序列。 3′端碱基：最好不用A。 PCR体系对反应物的要求 引物浓度 引物浓度 引物浓度过高会增加扩增结果的非特异性，并且会形成二聚体 上下游引物的终浓度应该一致 PCR体系对反应物的要求 DNA聚合酶 常用的为从嗜热水生菌（Thermas aquaticus L.）中提取的DNA聚合酶，称Taq DNA聚合酶 95℃可保持活性 70—75℃条件下可表现出最佳的生物活性，延伸速率在70℃时，60—70nt/秒，每分钟大于3.5kb 具体使用时，作为一个普遍规律，每扩增1kb，可用1分钟延伸时间 碱基错配率达2×10-4 —7.2×10-5 酶浓度范围一般为1～4U/100μl 酶量过多会导致非特异产物的增加 PCR体系对反应物的要求 PCR反应的缓冲液 Taq酶标准缓冲液： 10mmol/L Tris-HCl(pH8.3) 50mmol/L KCl 1.5mmol/L MgCl2 PCR体系对反应物的要求 PCR反应的缓冲液 Mg2+ 浓度影响反应特异性和PCR产率。 Mg2+最佳反应浓度相当低（1.5mmol/L），浓度变化范围为1～10mM 模板制备过程中带来的螯合剂（如EDTA）和负电荷离子基团（如磷酸根（dNTP）会影响Mg2+的有效浓度。必要时，对Mg2+浓度进行优化。 PCR体系对反应物的要求 dNTPs 高浓度的dNTP会抑制聚合酶活性，而且会增加错误dNTP的掺入几率；浓度过低则会影响产物产量 四种dNTP的浓度应该一致 PCR反应条件的选择 94℃ 4min 94℃ 30s Tm-5 ℃ 30s 72 ℃ 1min/1kb 72 ℃ 10min Tm=4(G+C) + 2(A+T) 30cycles RT-PCR 原理 Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction: RT-PCR 提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因 RT-PCR 原理图解 RT-PCR 反转录酶的选择 Moloney 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶，有强的聚合酶活性，最适作用温度为37℃ 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性，最适作用温度为42℃ RT-PCR 合成cDNA引物的选择 Oligo(dT) 与mRNA分子3′端的poly(A)互补 特异性强,仅mRNA可被转录 Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%,此种引物合成的cDNA在数量和复杂性方面要小 难以得到﹥3kb cDNA ,对某些RNA二级结构难以克服。 RT-PCR 合成cDNA引物的选择 随机六聚体的核苷酸 特异性差 克服反转录酶终止反应的序列。 通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA RT-PCR 合成cDNA引物的选择 特异性寡核苷酸引物 特异性强 RACE cDNA末端快速扩增技术 (rapid amplification of cDNA ends ) 3′RACE原理 反转录：利用mRNA 的3′末端天然的poly(A) 尾巴作为引物结合位点，以Oligo (dT) 和一个接头组成的接头引物(adaptor primer ,AP) 来反转录总RNA 得到加接头的cDNA 第一链。 第一PCR：然后用一个基因特异引物GSP1 (gene speci