四、药物致突变作用的检测方法.ppt

是利用隐性基因在伴性遗传中的交叉遗传特征而设计的。雄性果蝇X染色体的突变传给F1代雌性果蝇，F1代雌性果蝇为杂合性，不能表达；F1代雌性果蝇又传给F2代雄性果蝇，F2代雄性果蝇为半合性，能表达出来。 如果亲代雄性果蝇接触受试物后X染色体出现隐性致死突变，则F1代雌性果蝇中不表达，而F2代雄性果蝇中因有一半接受了这个已发生突变的X染色体，结果F2代雄性果蝇数目比雌性果蝇少了一半。 四、果蝇伴性隐性致死试验 实验动物果蝇是现代遗传毒理学上常用的实验昆虫，对化学物的代谢酶与哺乳动物相似，且世代周期短，繁殖率高，饲养简单是该法的优点；但蝇类的生殖腺和循环系统的结构与哺乳动物差异较大，所以，其结果在外推到哺乳动物或人时要慎重。 原理: 显性致死试验是观察哺乳动物生殖细胞染色体损伤的一种方法。生殖细胞在减数分裂期和受精期最易发生突变，突变后失去与异性生殖细胞结合的能力，或者结合后会出现发育不正常的胚胎，以致造成总着床数减少或早期胚胎死亡及畸胎等现象。 动物: 性成熟小鼠。每组至少15只雄鼠，20只以上孕鼠。 五、啮齿类动物显性致死试验 对照: 设阳性和阴性（溶剂）对照 剂量: 一般采用3个剂量组，最高剂量应导致毒性症状或减低繁殖力。 交配方法 （1）在最后一次给药当天开始与雌鼠交配. （2）每只雄鼠单独饲养，与2～3只未交配过的雌鼠同笼，5天后取出雌鼠，间隔1～2天后，再放入第二批雌鼠，如此持续6～8周。 观察与解剖: 雌雄同笼后，小鼠以阴栓（鼠于交配后，精液在阴道内凝固，如一白色栓塞堵在阴道中，叫做阴栓。小鼠的阴栓比较牢固，可在阴道内存留1-2天；大鼠的阴栓不牢固，容易脱落。检查大鼠的阴栓时，还应在笼底寻找阴栓）的出现作为妊娠第1天，若未检出阴栓，则从同笼的第三天记为妊娠第1天。于妊娠第14天处死雌鼠，观察双角子宫内着床数，吸收胎，晚期死胎及活胎数。 活胎、早期死亡胚胎（包括吸收胚胎）、晚期死亡胚胎的鉴别方法： （1）活胎：胚胎已完整成形，色鲜红，有自然运动，机械刺激后有运动反应。 （2）早期死亡胚胎：胚胎的大小、外形和色泽可因死亡时间的相对迟早及死后自溶时间的长短变化很大，一般胎盘较小或不明显，胚胎形体较小，外形不完整，各部位发育尚未完全，呈紫红色，无自然动作。 早期死亡的胚胎逐步吸收，既看不到胎鼠外观，也分不清胚胎和胎盘，仅在子宫内膜上隆起如一小瘤，故有人称它为胎膜瘤；如已完全被吸收，则可称为吸收点，即为最早的早期死胎。 （3）晚期死亡胚胎：胚胎完整成形，并有明显胎盘，但色泽灰暗，无光泽，无自然运动，机械刺激后亦无运动反应。 结果观察: 以给药组雄鼠为单位，交配后1~8周分别统计下列指标。 （1）平均受孕数（％）＝受孕母鼠总数/同笼母鼠总数×100％ （2）平均着床数＝总着床数（早死、迟死、活胎数）/ 受孕母鼠总数 （3）平均活胎数＝活胎总数/受孕母鼠总数 （4）平均死胎数＝死胎总数/受孕母鼠总数 （5）突变指数（M1）＝总死胎数／总着床数×100 （6）显性致死率（DL, ％）＝（1－实验组的平均生存胎仔数/阴性对照妊娠鼠的平均生存胎仔数）×100 结果判断: 根据上述结果综合评价，生存胎仔总数减少，死亡胎仔总数增加; 胚胎总着床数（活胎、早期死亡胚胎和晚期死亡胚胎的总和）减少或未着床胚胎数增加。 结果有统计学意义并有剂量反应关系时记为阳性显性致死效应。 正常细胞在有丝分裂过程中，仅在S期进行DNA复制合成。当DNA受损后，DNA的修复合成可发生在S期以外的时期，这种合成称为程序外DNA合成。 基本方法是测定S期以外3H-胸苷掺入胞核的量，这一掺入量可反映DNA损伤后修复合成的量。一般使用人淋巴细胞或啮齿动物肝细胞等不处于正在增殖的细胞较为方便，否则就需要人为地将细胞阻断于G1期，使增殖同步化。 六、程序外DNA合成试验 由法国巴斯德研究所 Quillardet 等于1982 年首先提出的一种遗传毒性检测方法, 通过直接监测细胞DNA受损后的SOS修复反应来检测化合物的生物遗传毒性。DNA分子在受到外因引起大范围损伤、其复制又受到抑制的情况下，会导致一种容易发生错误的修复。所有这些在遗传毒物处理后大肠杆菌中出现的一系列反应统称为SOS应答。 七. SOS显色试验 * 本试验系一种特异性的“β-半乳糖苷酶诱导试验”，一旦测试菌株DNA受损伤，即可使其产生SOS反应，组成该反应系统的RecA蛋白即转化为RecA蛋白水解酶。此酶可分解阻遏蛋白，使受阻遏的sfiA基因去阻遏，并启动lacZ基因翻译、转录、表达，其表达产物即为半乳糖苷酶。此酶可分解邻硝基苯β-D-半乳糖苷(ONPG)，产生黄色可溶性物质，根据其颜色的深浅对被诱导酶的数量进行定量测定，