第2讲 DNA的复制机理与PCR技术2幻灯片.pptVIP

第六章（二） DNA的复制机理应用—PCR技术 南昌大学生命科学学院 彭晓珏 1.DNA的复制 1. DNA的半保留复制 2. DNA复制的起点，方向和方式 3.DNA复制的过程 1.3 DNA的复制 1.3.1 DNA复制所需要的酶和因子 1. 原料：dNTP 2. 双链 DNA模板 3. 引物 4. 引物酶 5. 解旋酶 6. 单链结合蛋白 7. 拓扑异构酶 8. DNA聚合酶 1.3 DNA的复制 1.3. 2 DNA复制的过程 　　DNA复制的起始 　　DNA复制的延伸 　　DNA复制的终止 PCR反应动画 PCR反应所用的仪器 PCR仪 (2) PCR引物设计软件 1. Gene Run 2. Primer 5.0 琼脂糖凝胶电泳检测PCR片段 思考题 1.当你知道一个基因的某个片段的DNA序列 时，请设计一个实验把这个基因的全长扩出来？ 2. 如果有一株转基因植物出现了特异性的表型，如何判断是你转进去的基因所导致还是因为你转进去的基因插入某个功能基因的内部而导致？ 7. 实时荧光定量PCR 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 绝对定量 相对定量{ 3、反向 PCR （Inverse PCR）： 常规PCR可扩增位于二个引物之间的DNA片段，但不能扩增引物外侧的DNA序列，反向PCR则可扩增引物外侧的DNA片段，并对已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增和研究。 4、多重 PCR（multiple PCR） 多重PCR是在同一反应中采用多对引物同时扩增几个不同的DNA片段，如果基因某一区段缺失，则相应的电泳图谱上此区段PCR扩增产物长度减少或消失，从而发现基因异常。多重PCR具有灵敏快速特点，特别适用检测单拷贝基因缺失、重排、插入等异常改变，其结果与Southern blotting一样可靠，但多重PCR能检测小片段缺失。 5. 反转录PCR： RT-PCR (reverse transcription PCR) 特点：快速、简便、敏感性极高 。 目的： 检测RNA 原理：先在反转录酶作用下，以mRNA为模板合成互补的cDNA，再以此cDNA为模板进行PCR扩增。这样，低丰度的mRNA就得以扩增放大，便于检测。 6. 重组PCR： 目的：用于基因融合。 原理：巧妙地设计和利用寡核苷酸引物，进行初级和次级PCR反应。在初级PCR反应中，每对引物中的一个引物的3’端与待重组的基因互补，5’端则与另一个待重组基因互补。分别进行PCR，所得的两种PCR产物有部分重叠序列，混合两种不同的PCR产物进行次级PCR，基因就得到了融合。 奢侈基因 管家基因 伯乐公司的iCycler 系列的定量PCR仪 本 章 结 束！谢 谢！ 1.3 DNA的复制 * * * * * * * * * * * * * * * Invention 1985, Kary B. Mullis Science Nobel Price in Chemistry 1995 for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method DNA复制原理的应用——PCR技术 (一)、PCR技术的基本原理 PCR是指那些模拟体内DNA复制的方式在体外选择性的扩增DNA上的某个特定区段的技术。 PCR在人类社会中应用广泛: DNA指纹鉴定， 血液中病毒检测等 PCR的4种基本要素： ① ssDNA模板、② ssDNA引物、③合成DNA的4种原料dNTP、④DNA聚合酶。 PCR反应的3种基本过程： ①变性、②退火、③延伸 Schematic diagram of PCR (二)、PCR反应所需物质与扩增过程 Taq DNA聚合酶：2499 bp 嗜热水生菌Thermus aquatics YT-1菌株。 活性： 温度 半衰期 温度 合成速率： 92.5 ℃ 130分钟 72-80 ℃ 150-300 个/s 95 ℃ 40分钟 70 ℃ 约