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乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针“一管法”） 实验操作培训 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 预期用途 　　乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的一种疾病，主要通过血和血制品、母婴传播及性接触传播。乙型肝炎病毒感染者临床表现多样化，潜伏期较长，最常见的临床表现有食欲减退、恶心、呕吐、腹胀、乏力等症状，部分患者有低热等症状。人感染HBV后，病毒持续6个月仍未被清除者可发展为慢性肝炎，导致肝硬化或肝癌。 　　该产品采用实时荧光定量PCR扩增检测技术，用于定量检测已确诊为HBV DNA阳性患者血清或血浆中的HBV DNA。 检验原理 　　本试剂盒采用微量核酸释放剂快速裂解、释放血清或血浆样本中的HBV DNA，利用针对HBV核酸保守区设计的一对特异性引物、一条特异性荧光探针，配以PCR反应液，在荧光定量PCR仪上，应用实时荧光定量PCR检测技术，通过荧光信号的变化实现HBV DNA的定量检测。 　　本试剂盒系采用微量核酸释放剂(MNRR)，可在一管中进行HBV DNA核酸提取与扩增，对3l的微量血清或血浆样本直接进行快速、准确定量的荧光PCR系统；微量核酸释放剂在完全释放核酸的同时，还具有封闭样本中对PCR扩增具有干扰作用的蛋白质、药物及溶血等各种因素物质的功能，避免检测过程的假阴性。 　　此外，标准品直接采用灭活后的血清质控，与样本同时进行处理与检测，实现全程监控与准确定量。 主要组成成份 操作步骤及注意事项 一、试剂准备（在试剂准备区进行） 1、取出试剂盒，室温放置，充分溶解后混匀并瞬时离心 注意：a、试剂要闭光放置，-20℃保存，避免反复冻融 b、试剂盒打开后核酸释放剂和促荧光剂可以4℃保存，其余成分-20℃保存，随用随取，用完立即放回。 c、两个质控品和四个标准品使用前可以涡旋震荡然后瞬时离心，其它四种成分不可涡旋震荡，需要混匀的可轻轻颠倒混匀 一、试剂准备（在试剂准备区进行） 2、根据待测样本、HBV阴性质控品、HBV临界阳性质控品(OT)、HBV定量标准品(OT)Ⅰ~Ⅳ的数量，按比例取相应量的试剂加入灭菌的离心管中，制备成PCR-mix，混匀并瞬时离心后备用，比例如下： 注意：a、HBV酶混合物最后加，并且需要快速放回存储设备 b、加酶混合物前需润洗枪头2-3次，然后缓慢加样 c、在混匀和离心时注意闭光 d、PCR-mix可在样本处理结束后配制 操作步骤及注意事项 二、样本处理（在样本处理区进行） 1、取3 ul核酸释放剂，加入PCR反应管中 注意：需要过吸加样，并且垂直加入PCR反应管底部 2、分别取待测样本、HBV阴性质控品、HBV临界阳性质控品(OT)、HBV定量标准品(OT)Ⅰ~Ⅳ各3ul加入对应的PCR反应管中，并用移液器在管底吹打混匀3~5次 注意：常规吸样（无需过吸，移液器不要碰触样品管管壁），加样时垂直进入PCR反应管加样，然后移液器稍微倾斜快速吹打3-5次（不要有气泡产生），最后垂直退出移液器（退出时枪头不要碰触PCR反应管管壁） 操作步骤及注意事项 二、样本处理（在样本处理区进行） 3、各PCR反应管中分别加入30 ul无菌石蜡油，然后在PCR反应管口贴上封口膜 注意：悬空加入无菌石蜡油（不要有气泡产生），八连排PCR反应管可以盖上相应的盖子，若是用移液器，需要在吸样前润洗枪头2-3次，然后缓慢加样 4、将PCR反应管放置在荧光定量PCR仪中进行反应。反应温度及时间设定如下： 温度 时间 95℃ 10分钟 注意：此反应也可使用专用的恒温装置；PCR反应管不能直接放在95℃直接反应，需要放置好PCR反应管后开始升温，反应结束后需要等温度降到室温再去下PCR反应管进行后面的操作 操作步骤及注意事项 三、PCR扩增（早扩增与分析区进行） 1、将经过裂解处理后的PCR反应管从荧光定量PCR仪中取出，撕弃封口膜，在各管中按33ul /管加入前面所制备的PCR-mix，悬空加入到反应管内，瞬时离心 2、PCR扩增程序设置 结果分析 一、根据不同的仪器和结果，可适当的调整基线和阈值 二、质量控制 1、HBV阴性质控品：无S型扩增曲线或无CT值显示； 2、HBV临界阳性质控品(OT)：呈S型扩增曲线且检测浓度介于1.0×102