分子生物学实验Experimentsofmolecularbiology.pptVIP

实验二 质粒DNA的酶切鉴定 【目的要求】 1．了解一般限制性内切酶的特性； 2．学习设计酶切方案的一般规律,载体与供体进行酶切 ； 3．掌握酶的保存与使用方法； 【实验原理】 限制性内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的特定的核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶，共有I型、、II型、III型三类， II型限制性内切酶识别含4－8个核苷酸且具有回文对称性质的核酸序列，并在识别序列内或侧旁特异性位点切开DNA双链，产生平齐末端和带单链突出端（粘性末端）的DNA片断，常用于基因克隆的载体切割、外源DNA的制备。在分子克隆中I、III类型限制性内切酶都不常用。 【实验器材】 台式离心机、振荡器，恒温水浴，微量移液器（20uL, 200 uL 1000uL）,1.5mL Enpendorf管 【实验材料】 限制性内切酶及酶切缓冲液、无菌水， 【实验内容】 1．酶切有关基础知识介绍： 2．小量酶切，电泳鉴定 3. 酶切体系的建立： 表3. .质粒酶切反应体系的建立 影响限制性内切酶的因素很多，酶反应条件是实验成功的重要因素，其中包括反应的温度、时间与反应的缓冲体系、DNA的纯度和浓度等。 酶切反应体系的组成：DNA量→酶量（最多占总体积的1/10）→总体积，即根据所用DNA的量确定用酶量，再根据用的酶量确定总体积。一般较好的酶切反应体系中DNA用量不高于1.5ug/50uL。酶切时加样顺序一般应为：水+缓冲液+DNA+酶，以保证酶的活性。向管中加入每个组分后都要用手指轻拨管子以利混匀，最后加酶混匀，5’离心后保温酶切。 限制性内切酶分类 I型限制性内切核酸酶有其特定的DNA识别序列，但酶在DNA上的切割位置远离其识别位置，有的酶可在同识别序列相距1 000 bp的位置上随机切割。 l型限制酶对体外重组DNA实验没有多少用处。 III型限制性内切核酸酶在DNA上有其特定的识别序列，其酶切位置在识别序列3‘端之外相距约20个碱基对处，可以产生各种类型的单链末端。Ⅲ型酶有其特定的用途。 II限制性内切核酸酶在DNA上有其特定的识别序列即，回文结构，通常为4-8bp，在特定识别位点处切割DNA。是基因工程中主要使用的酶类。 （1）同裂酶（Isoschizomers) ② 不完全同裂酶： （2）同尾酶(Isocaudamers） 部分同裂酶的切割位点 部分同尾酶切割位点 影响限制性内切酶活性的因素 2. DNA的甲基化程度 3. DNA的分子结构 4. 缓冲液(Buffer) 5. 酶切消化反应的时间和温度 6. 反应体积和甘油浓度 7. 星号（*）活性 限制酶酶切反应的终止 * * 组成成分 单酶切 双酶切 质粒 6~8 6~8 酶1 0.5 0.5 酶2 --- 0.5 10X缓冲液 2 2 去离子水 11.5 12 总体积 20 20 限制酶特点： 1.识别４-8个相连的核苷酸，以6个多见； 限制性内切酶的识别序列 BamH I 5’-G?GATCC-3’ 3’-CCTAG?G-5’ Not I 5’-GC?GGCCGC-3’ 3’-CGCCGG?CG-5’ 2.呈回文结构(palindrome)； 3.旋转对称性； EcoRI 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ 4.切点大多数在识别顺序之内，也有例外。 Fok I 5’-GGATGNN ? -3’ 3’-CCTAC ? NN-5’ 外侧，产生3’-端突起 5. 识别序列严格，少数有变动，序列中的核苷酸被甲基化后，不能被切割。 限制性内切酶的切割方式 内切酶切割后产生的三种末端 a) 5’ 突出的粘性末端 如, EcoR I 5’-G ? AATTC-3