实验2荧光显微镜的使用简析.ppt

任课教师：齐云峰 荧光显微镜的使用 实验目的 掌握荧光显微镜的结构、原理及其使用方法。 实验用品 荧光显微镜及荧光装置附件。人口腔上皮细胞装片，植物茎部组织装片。 实验原理 荧光显微镜是一种较为常用的光学显微镜。它是由光源、滤色镜系统和光学系统等主要部件组成。 其基本原理是利用一定波长的激发光对样品进行激发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。 透射荧光显微镜的构造 透射荧光显微镜原理 反射荧光显微镜原理 实验原理 某些物质经波长较短的光照射后，分子被激活,吸收能量后呈激发态。 其能量部分转化为热能或用于光化学反应外，相当一部分则以波长较长的光能形式辐射出来，这种波长长于激发光的可见光称为荧光。 荧光显微镜是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。 什么是荧光 ? 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。 即：物质吸收短波光，发射出的长波光。 荧光光源的作用 荧光光源不是作为照明的，而是作为荧光色素产生荧光的激发光。 实验原理 荧光有两种类型，一种是标本自身的原有荧光（自发荧光），另一种是利用荧光色素和细胞的特定部分反应所产生的荧光（次生荧光）。 自发荧光：在生物的某些组织中，经紫外线照射后能直接发射出荧光的称为自发荧光（或直接荧光）。如植物组织中的叶绿素，经紫外线照射后，即可发出红色荧光。 次生荧光：有些生物组织经紫外线照射后，并不能发出荧光，但是当它吸收荧光染料后也可以产生荧光，称为次生荧光（或间接荧光）。如吖啶橙，DAPI均可检测细胞内的核酸。 荧光显微镜的基本结构组成 一、光源　　由于标本发出的荧光和激发光相比，是非常微弱的，因此荧光显微镜的光源强度必须很高，所以对于荧光显微镜的光源我们通常采用高压汞灯。 汞灯能以最小的表面发出最大数量的紫外光和蓝光，且光亮度大，光度稳定。它是用石英玻璃制作，中间呈球形，有两个钨电极，内充一定数量的汞和少量氩氖混合气体。 一、光源 工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水银完全蒸发时，可达50～70个标准大气压力，这一过程一般约需5～15min。 超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物质。 超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良好的散热条件，工作环境温度不宜太高。  一、光源 200W超高压汞灯的平均寿命，在每次使用2h的情况下约为200h，开动一次工作时间愈短，则寿命愈短，如开一次只工作20min，则寿命降低50%。 因此，使用时尽量减少启动次数。灯泡在使用过程中其光效是逐渐降低的。灯熄灭后要等待冷却才能重新启动。 点燃灯泡后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要等15min。 一、光源 超高压汞灯（100W或200W）光源的电路和包括变压、镇流、启动几个部分。 在灯室上有调节　灯泡发光中心的系统，灯泡球部后面安装有镀铝的凹面反射镜，前面安装有集光透镜。 由于超高压汞灯压力很高，紫外线强烈，因此灯泡必须置灯室中方可点燃，以免伤害眼睛和发生爆炸时造成操作。 滤色镜按用途或功能，主要分为两类： 1、激发滤色镜（exciter filter） 对于光源发出的混合光，选择透过能使标本产生荧光的特定波长的光，同时阻挡对激发荧光无关的光。 荧光染料均有一定的吸收光谱（激发峰值），利用滤色镜对光线选择吸收的能力，选用其透射光谱，恰为荧光染料的最大吸收光谱（激发峰值）的激发滤色镜，以便从汞灯发出的广谱光波中，选择透过最宜波段的光线供用。 2、阻挡滤色镜（barrier filter） 阻挡滤色镜是用来阻挡掉没有被标本吸收的激发光和某些波长较短的光线以及没有被选择透过的荧光，以防伤害眼睛。 阻挡滤色镜的选用，应视荧光染料的荧光光谱而定，要能够最大限度的透过所需荧光并阻断短波光以及不需要波长的荧光。 滤镜一般都以基本色调命名，前面字母代表色调，后面字母代表玻璃，数字代表型号特点。 如德国产品（Schott）BG12，就是种蓝色玻璃，B是蓝色的第一个字母，G是玻璃的第一个字母； 我国产品的名称已统一用拼音字母表示，如相当于BG12的蓝色滤镜名为QB24，Q是青色（蓝色）拼音的第一个字母，B是玻璃拼音的第一个字母。 不过有的滤镜也可以透光分界波长命名，如K530，就是表示阻挡波长530nm以下的光而透过530nm以上的光。还有的厂家的滤镜完全以数字命名，如美国Corning厂的NO.5-58，即相当于BG12。 3、二向色镜（D