右归胶囊提液对小鼠卵巢颗粒细胞雌激素.docVIP

右归胶囊水提液对小鼠卵巢颗粒细胞雌激素、孕酮分泌的影响及机制 徐晓娟 金沈锐 秦旭华 成都中医药大学( 四川成都610075) 摘要: 目的: 观察右归胶囊水提液对卵巢颗粒细胞分泌雌激素、孕酮功能的影响。方法:首先运用体外培养技术进行小鼠卵巢颗粒细胞体外培养,采用直接给药法,观察右归胶囊水提液对小鼠卵巢颗粒细胞雌激素、孕酮的分泌量(放射免疫测定法) ,并用检测卵巢颗粒细胞内cAMP水平(ELISA法)。结果:右归胶囊水提液高剂量组(0.18g/ml) 可明显增加颗粒细胞雌激素、孕酮分泌量(P0.01) ,同时显著增加颗粒细胞内cAMP的浓度(P0.01)。结论:右归胶囊温补肾阳的作用可能与直接促进颗粒细胞的分泌功能有关,同时,其作用途径可能是通过激活颗粒细胞内酰苷酸环化酶而实现。 关键词: 右归胶囊 卵巢颗粒细胞 雌激素 孕酮 cAMP 中图分类号: R28515 文献标识码: A 文章编号:1000-3649(2006) 05- 0022-02 右归胶囊是温补肾阳代表方,出自《景岳全书》,功效补肾助阳、填充精血,临床上常用于治疗月经后期或伴量少、闭经、不孕症等多种病症,中医辨证属肾阳虚精血亏虚者。该方针对性强, 疗效确切,在中医妇科使用十分广泛。为深入探讨该方的作用机理, 我们采用卵巢颗粒细胞体外培养技术,观察了右归胶囊水提液对NIH小鼠卵巢卵泡细胞雌激素、孕酮分泌,及细胞内cAMP水平的影响。报告如下。 1 材料与方法 1.1 动物 雌性NIH小鼠,体重17-19g,由四川省医学科学院实验动物研究所提供,合格证号为:SCSK(川)2004-16。 1.2 药物与试剂 1.2.1 主要试剂 DMEM 培养液(Gibco)；胰蛋白酶(Gibco) ; 孕马促性腺激素血清(PMSG,天津华孚高新生物技术公司)；雌二醇(E2)放射免疫测定试剂盒(北京北方生物技术研究所,批号: 050720)、孕酮(P)放射免疫测定试剂盒(天津德普诊断产品有限公司,批号: KPGD10117)；cAMP ELISA(lowpH )测定试剂盒(RDsystems公司,批号:05Y018) 。 1.2.2 药物 右归胶囊处方由熟地24g、山药12g、山萸9g、枸杞12g、鹿角胶12g、菟丝子12g、炒杜仲12g、当归9g、肉桂6g、制附子6g组成, 以该方制备含量生药1.14g/ml的水提液, 水提液经0.22Um微孔滤器过滤后备用。 1.3 仪器 Thermo Labsystems Multiskan MK3全自动酶标仪; GC-1200C自动放射免疫分析仪(科大创新股份有限公司) 。 1.4 颗粒细胞的采集 取雌性NIH小白鼠,每只皮下注射PMSG0.1ml, 48h后,颈椎脱臼处死,无菌条件下迅速取出双侧卵巢,去除周围脂肪和被膜,放于含0.1%胰酶DMEM的培养液中,将卵巢切碎,针头刺破卵泡,37℃、5%CO2的细胞培养箱中孕育消化1hr, 终止孵育时用吸管轻轻吹打数次以分散细胞。消化液经尼龙网过滤, 滤液用DMEM培养液(10%胎牛血清)低速离心(1000rpm)沉淀3次,弃上清液。 1.5 实验方法 1.5.1 右归胶囊水提液对颗粒细胞分泌E2、P水平的影响 用DMEM培养基将卵巢细胞稀释成1×105/ml浓度的单细胞悬液,接种到24孔板上,培养24h后,细胞呈单层贴壁生长后,加入不同浓度的药物(设空白对照孔、药物处理孔,均设6复孔,空白对照孔用等体积DMEM 培养液代替受试药物),实验孔6孔板置37℃、5% CO2的细胞培养箱中, 继续培养48h后,收集培养液,离心后用上清液检E2、P水平,具体方法按试剂盒说明进行。 1.5.2 右归胶囊水提液对颗粒细胞cAMP 水平的影响 用DMEM培养基将卵巢细胞稀释成1×105/ml浓度的单细胞悬液,接种到6孔板上,培养24h后,细胞呈单层贴壁生长后, 加入不同浓度的药物(设空白对照孔、药物处理孔,均设4复孔,空白对照孔用等体积DMEM 培养液代替受试药物）,将6孔板置37℃、5% CO2的细胞培养箱中,继续培养24h后,弃去培养液,PBS洗涤1次,弃PBS后,加入0.1N的盐酸裂解细胞。镜下观察,待细胞裂解后,收集细胞裂解液,经离心,取上清液立即进行cAMP水平检测,具体方法按试剂盒说明进行。 116 统计学处理 用中国医学百科全书.医学统计学统计软件包PEMS3.1 进行。 2 结 果 2.1 提取液对颗粒细胞雌激素(E2)、孕酮(P)分泌的影响 结果见表1。 表1右归胶囊水提液对雌激素(E2)、孕酮(P)生成的影响(72h) (x±s n=6) 组别 药物浓度 E2(pg/ml ) P(ng/ml) 空白对照组 —