抗vegf受体单克隆抗体及其制备方法和应用材料.doc

抗vegf受体单克隆抗体及其制备方法和应用CN 101245106 B 摘要 本发明涉及一种人源抗VEGF受体II单克隆抗体。提供了单克隆抗体的免疫球蛋白重链和轻链氨基酸序列，该单克隆抗体的制备方法和在制备抑制血管生长药物中的应用。本发明的单克隆抗体适用于制备治疗肿瘤和视网膜病变的药物。 权利要求(8) 1. 一种血管内皮细胞生长因子受体2的单克隆抗体，具有SEQ ID No. 1所示的免疫球 蛋白重链氨基酸序列和SEQ ID NO 2所述的免疫球蛋白轻链氨基酸序列。 2. 一种编码权利要求1所述单克隆抗体的DNA。 3.根据权利要求2所述的DNA，其特征在于，所述的DNA序列为cDNA。 4. 一种含有权利要求2所述DNA的核酸载体序列。 5. 一种携带权利要求2所述DNA的宿主细胞。 6.权利要求1所述单克隆抗体的制备方法，依次包括如下步骤：(1)逆转录权利要求5所述的宿主细胞的总RNA，获得cDNA ；(2)利用SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 4为反向引物，以步骤⑴所述的cDNA为模板，通 过PCR扩增获得血管内皮细胞生长因子受体2抗体重链和轻链的DNA序列；(3)将步骤（2)所述的血管内皮细胞生长因子受体2抗体重链和轻链的DNA序列分别 插入到哺乳动物表达质粒；(4)将步骤C3)所述的质粒纯化，通过共转染CHO细胞得到从质粒表达的重组抗体； 或者，依次包括如下步骤：(1)将权利要求3所述的cDNA插入到编码有二氢叶酸还原酶的质粒，使重链和轻链的 cDNA位于同一质粒，并且分别由各自的CMV启动子驱动，二氢叶酸还原酶基因由SV40早期 启动子驱动；(2)提取步骤（1)所述的质粒并将质粒转人二氢叶酸还原酶缺陷的CHO细胞；(3)选择性培养经过消化的步骤（?所述的CHO细胞，筛选高表达的细胞株；(4)将步骤C3)获得的细胞株进行MTX梯度加压，MTX浓度最终加至500-2000nM，选择表达量最高的克隆。 7. 一种用于制备抑制血管生长药物的组合物，包含治疗有效浓度的权利要求1所述单 克隆抗体和药学上可接受的载体。 8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述的治疗有效浓度范围为静脉注射 每千克体重0. 1?IOOmg或眼内玻璃体注射每眼0. 01?lOOmg。 说明抗VEGF受体单克隆抗体及其制备方法和应用 技术领域 [0001] 本发明属生物技术领域，特别是涉及一种单克隆抗体。 背景技术 [0002] 血管新生（angiogenesis)是指从已经存在的血管上生长出新的血管的过程。对 绝大多数成年个体的器官来说，正常情况下并无血管的新生。血管新生在正常生理状况下 只见于极少数的组织器官，例如月经周期中的子宫内膜等。但在某些病理状态下，例如肿瘤 和创伤修复等过程中，可发生血管新生。业已证明，在肿瘤等疾病，血管新生是疾病发展过 程中的重要步骤。如果能抑制血管新生，便可阻止肿瘤等疾病的病情发展，从而达到治疗 疾病之目的(Folkman, 2002, Role of angiogenesis in tumor growth and metastasis, Semin Oncol. 29(6Suppl 16) :15-8 ；Witmer et al. ,2003, Vascularendothelial growth factors and angiogenesis in eye disease, Prog RetinEye Res. 22:1—29。 [0003] 血管新生受多种因子的调控，其中血管内皮细胞生长因子（vascularendothelial cell growth factor, VEGF)是诱导血管新生的关键因子(Leung etal.，1989，Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenicmitogen, Science,246 ： 1306-1309 ；Ferrara et al.,2003, The biology ofVEGF and its receptors, Nature Medicine 9:669-676)。VEGF是一种多肽，可由多种细胞分泌产生，在肿瘤细胞VEGF的表 达量尤其高。且其表达量与肿瘤的恶性程度成正比。VEGF与位于血管内皮细胞的特异受 体相结合，经受体信号传递系统刺激血管内皮细胞的分裂增生，形成新的血管。VEGF可与两 个受体结合，它们分别是VEGF受体I (VEGFRl)和VEGF受体II (VEGFR2)。其中VEGFR2是 传导VEGF信号，促进血管形成的关键受体（Neufeld et al.，1999，Vascular endothelial growth factor (