5基因的重组与转移.ppt

* * 外源DNA 载体DNA 重组分子 原核细胞 真核细胞 扩增或表达 表达 连接 转化或转导 电穿孔或显微注射 受体细胞 第五章 基因的重组与转移 一、粘性末端的连接 DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起。 第一节 DNA片段的体外连接 ligase nick 二、齐平末端（blunt end）的连接 1. 直接连接 T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。 5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。而且目的DNA再切不下来 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ -OH -OH -P -P P- P- HO- HO- 5’ 3’ -OH -P P- HO- 5’ 3’ 1972年，斯坦福大学的P. Labban和P. Kaiser提出。 （1）同聚加尾 法 2. 人工加尾形成 “粘性末端” DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。 ①原理： 分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。 ②加尾—碱基互补 ④缺点： ③优点： 能把任何片段连接起来 不能把插入片段再切下来。 非酶切位点 用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。 （2）衔接物(linker)连接 ① linker 用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。 GGAATTCC CCTTAAGG EcoRI linker： ② linker的作用 ④缺点： 1）可以用内切酶把插入片段切下来。 如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段 2）能给载体连接上Polylinker: ③优点： 1. 与T载体直接连接 （1）PCR产物两个3’端一般都有一个A Taq DNA聚合酶的特性：在DNA双链的3’端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）。 （2）T载体的两个3’端人为地各加一个T 利用Taq DNA聚合酶，当原料中只有dTTP时，被迫在平端载体上添加T！ 三、PCR产物的连接 A A dNTP T T dTTP Taq DNA聚合酶 载体 PCR产物 TA TA 2. 在引物的5’端设计酶切位点 符合载体的多克隆位点； （1）设计原则 （2）带酶切位点的引物的结构 3’端15~20bp与模板互补； 5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列。 （5’端多余的3~5bp属保护碱基） 避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。 引物1 GCAGAATTC 互补序列 模板 EcoRI位点 5’- -3’ GCAGAATTC 互补序列 5’- -3’ 3’ 模板 GCAGAATTC 互补序列 PCR产物 5’- -3’ 3’ 复性 延伸 模板 模板 3’ 3’ GCTAGCCGG 互补序列 模板 BamH I 位点 -5’ 3-’ 5’ 复性 延伸 模板 模板 3’ 3’ GCTAGCCGG 互补序列 -5’ 3’- 模板 5’ GCTAGCCGG PCR产物 互补序列 -5’ 3’- 引物2 带酶切位点的PCR产物 GCAGAATTC PCR产物 5’- -3’ GCTAGCCGG PCR产物 -5’ 3’- CGTCTTAAG CGATCGGCC EcoRI位点 BamHI位点 AATTC PCR产物 5’- -3’ GCTAG PCR产物 -5’ 3’- G C EcoRI BamHI 两头各有一个粘性末端！ 四、DNA体外连接应注意的事项 插入片断与载体的酶切位点互补 相同的粘性末端才能有效地连接。 尽量避免平端连接。 决不能进行非粘性末端连接。 EcoRI EcoRI EcoRI （1）用相同的酶切 （2）用同尾酶切 BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII 都产生GATC4个碱基的粘性末端。 2. DNA插入的方向正确 （1）用双酶切 由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。 EcoRI BamHI EcoRI BamHI EcoRI BamHI 3. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确 （1）DNA定向插入 （2）起始密码 尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。 ATGGAATTC 载体 ATGCGGAATTCT 插入片断 EcoRI EcoRI ATGGAATTC T 重组 但移码突变！ 4. 防止载体自身环化连接 （1）提高插入片断的用量 连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。 （2）用碱性磷酸酶处理载体 载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。 5’ 3’ 载体 插入片断 1. 载体自身环化连