第十四章基因工程导论.pptVIP

第十四章 基因工程导论 基因工程：指采用类似工程设计的方法，人为地在体外将核酸分子插入质粒、病毒或其他载体中，构成遗传物质的新组合，并将它转移到原先没有这类分子的寄主细胞中扩增和表达。 第一节 基因工程的原理和一般方法 基因工程的基本原理 基因工程的基本内容和技术 （一）基因工程的基本内容 （1） 分离目的基因 ，或 人工合成基因； （2）与载体分子在体外连接，形成重组DNA分子； （3）把重组DNA分子引入到适宜的受体细胞中进行扩增； （4） 获得重组DNA分子的受体细胞的克隆； （5）提取已扩增的目的基因后，或再将其克隆到表达载体上，导入寄主细胞，以便在新的背景下实现功能表达，产生人们所需要的物质；或是将已扩增的目的基因做进一步的分析研究。 重组工程菌株的构建 WT-ADI DH5? -pET-28a -arcA acrA ADI pET-28a -arcA Rosetta -pET-28a -arcA （二）基因工程的基本技术 核酸电泳技术 核酸杂交技术 转化技术 DNA的酶切和连接技术 DNA测序技术 DNA 合成技术 PCR技术 PCR扩增基因： 　聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)可以体外快速扩增DNA。 　　美国Mullis(1986)发明(现代生物学发展史上的里程碑)。 PCR反应三个步聚(一个循环)： 1. 变性：94~95℃使模板DNA双链变成单链； 2. 复性：50~70℃下，引物分别与互补DNA单链互补配对； 3. 延伸：在引物的引导和Taq酶作用下，72 ℃下合成模板 　　　　DNA的互补链。 PCR反应通常有25~35个循环，一般可扩增5kb左右的片段。 由该技术衍生出一些新的技术， 如RAPD和AFLP等技术。 Sanger(1977)发明的双脱氧核糖核酸终止法测定核酸序列。 在Sanger双脱氧法中，可用荧光标记来代替放射性标记： 基因打靶：指通过转染的DNA序列与细胞内同源的基因组序列（靶序列）之间进行同源重组，以改变靶序列来研究其结构和功能或进行基因治疗的技术。 反义mRNA技术：通过向细胞导入一段与特定编码mRNA互补的非编码RNA链，使其与该段mRNA特异性结合而定向阻抑靶基因表达的技术。 RNA干扰：双链RNA特异性地作用于与其序列配对的基因而抑制其表达的现象。 克隆羊多莉 名字：Dolly 　　名字来源：美国乡村音乐女歌手多利·帕顿（Dolly Parton） 　　性别：雌 　　编号：6LL3 　　出生日期：1996年7月5日 　　出生地点：英国爱丁堡市罗斯林研究所 　　死亡日期：2003年2月14日 维尔穆特博士与体细胞克隆羊“多莉” 在培育多莉的过程中，科学家采用体细胞克隆技术，主要分四个步骤进行： ①从一只六岁雌性的芬兰多塞特(Finn Dorset)白面绵羊（称之为A）的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的培养液中，细胞逐渐停止分裂，此细胞称之为供体细胞。 ②从一头苏格兰黑面母绵羊（称之为B）的卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即将细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞。 ③利用电脉冲方法，使供体细胞和受体细胞融合，最后形成融合细胞。电脉冲可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能像受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞。 ④将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊（称之为C）的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成小绵羊多莉。