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第十二章 免疫检测原理及方法 第十二章 免疫检测原理及方法 免疫检测技术对于基础和临床兽医学发展以及在疾病诊断、预防和治疗以及研究疾病起因、发生和发展的方面都有着极其重要的意义。 免疫学技术的改进和发展，是建立在许多其他生物科学的技术之上，如用生化和蛋白分离技术分离抗原和抗体、用分于遗传学技术闸明免疫学上重要分子的基因序列。另一方面，免疫学又形成了许多本学科的技术，尤其是依据于抗原-抗体反应有高度特异性，作为检测手段胜过任何其他方法在这方面的优势。 第一节 抗原或抗体的体外检测 抗原与相应抗体在体外可以发生特异性结合，由于抗原的物理性状及参加反应其他辅助物质的不同，抗原和抗体结合后可出现凝集、沉淀、补体结合等反应。对这些现象进行分析、观察，可鉴定抗原或抗体。用已知抗原检测未知抗体，也可用已知抗体检测未知抗原。由于试验时要用血清作为试验材料，所以这种抗原－抗体的试验方法常称为血清学反应或血清学试验。 现在由于抗体纯化技术及单克隆抗体技术的建立与应用，抗体不一定都来自血清，血清学试验一词的应用范围已不如以往普遍了。 一、抗原—抗体反应总论 (一)抗原一抗体反应的特点 1.高度特异性 2.表面的结合 3.一定比例范围内结合 4.结合反应分两个阶段 (二)影响抗原一抗体反应的因素 1.电解质 2.温度 3.pH值 二、抗原-抗体反应的基本类型 由于新技术不断出现，抗原-抗体反应种类繁多。尽管如此，基本类型主要还是凝集反应、沉淀反应、浊度反应、补体介导反应和中和反应。上述反应的抗原特点、抗体名称、辅助条件、表现形式以及方法的敏感度各不相同。 近年来，在上述基本反应基础上，采用荧光素、同位素和酶标记技术，使抗原-抗体反应敏感度增加1,000倍以上。这种免疫标记方法已广泛应用到医学、兽医学以及其他生物学许多领域中。 二、抗原-抗体反应的基本类型 (一)凝集反应 1.直接凝集反应——玻片法、试管法 2.间接凝集反应 3.补体结合反应 (二)沉淀反应 1.琼脂扩散试验 2.絮状沉淀法 3.环状试验 (三)免疫比浊法 (四)血清补体（CH50）的测定 (五)免疫标记技术 1.免疫荧光法 荧光素结合到抗体分子上，用荧光标记抗体浸染可能含抗原的细胞或组织切片，在荧光显微镜下可见发荧光物体，以此对标本中相应抗原进行鉴定和定位。 (1)定性法——①直接法、②间接法、③补体法 (2)定量法——显微荧光光度计、流式细胞仪 2.免疫酶标记法 用酶标记抗体(或抗原)，用酶的底物来显示抗原抗体反应，这种方法具有操作简便、安全，等特点。 (1)ELISA——直接法、简接法、夹心法、竞争法 (2)酶联免疫电泳转移印迹法(Westerb-Blot) (3)斑点免疫结合试验(Dot-ELISA) 3. 放射免疫测定法 原理是待测抗原和标记抗原与定量的相应抗体发生竞争性结合。待测抗原是动物内的某种微量活性物质，如细菌和寄生虫的可溶性抗原、激素类、细胞内信使如cAMP、cGMP和前列腺素E等。 标记抗原是将已知的上述物质标记上放射性同位素(125I、131I 3H、4C、32P)。将标记抗原(Ag?)和未标记抗原(Ag)按比例混合，再使两者与定量的相应抗体(Ab)发生竞争性结合，也即竞争抑制反应。 第二节 免疫细胞的检测 参与免疫应答的细胞有多种，如负责体液免疫的B细胞，执行细胞免疫的T细胞和沟通体液免疫和细胞免疫的其他细胞等。 T细胞、B细胞表面具有特异性抗原和多种受体，据此建立了相应的检测方法，以鉴定和计数动物外周血液和淋巴样组织中的T细胞、B细胞及其功能。 一、免疫细胞的定量检测 (一)T细胞的定量检测 检测T细胞数量最早和最普及的试验是红细胞花环试验，按花环阳性淋巴细胞百分率表示。 目前，可通过检测T细胞表面CD抗原，了解外周血T细胞数量或亚群的变化。从外周血分离出富含的单个核细胞制合成适当数量的细胞悬液，分放在3个小试管中，分别用抗CD3、CD4和CD8的单克隆抗体作为第一抗体进行结合，再用FITC标记的兔小鼠IgG抗体作为第二抗体进行间接免疫荧光染色。可在荧光显微镜下或用流式细胞仪观察结果。 (二)B细胞数量的检测 B细胞表面有多种标志，如SmIg、IgG的Fc受体、补体受体等。通过检测SmIg，了解成熟B细胞的数量，将单个核细胞用FITC标记的兔抗免疫球蛋白作直接免疫荧光染色，显荧光的细胞为SmIg+细胞，即B细胞。 溶血空斑试验是体外检测抗体形成细胞的一种方法，即将经红细胞(RBC)免疫过的家兔淋巴结或小鼠脾脏制成细胞悬液，与一定量的RBC结合，于