RT-PCR步骤.docVIP

下载本文档

8
0
约1.17千字
约 3页
2017-02-15 发布于重庆
举报
版权申诉

RT-PCR步骤.doc

1、有哪些信誉好的足球投注网站（book118）网站文档一经付费（服务费），不意味着购买了该文档的版权，仅供个人/单位学习、研究之用，不得用于商业用途，未经授权，严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等，侵权必究。。
2、本站所有内容均由合作方或网友上传，本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺！文档内容仅供研究参考，付费前请自行鉴别。如您付费，意味着您自己接受本站规则且自行承担风险，本站不退款、不进行额外附加服务；查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档，您可以点击这里二次下载。
3、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等，请点击“版权申诉”（推荐），也可以打举报电话：400-050-0827(电话支持时间：9:00-18:30)。
4、该文档为VIP文档，如果想要下载，成为VIP会员后，下载免费。
5、成为VIP后，下载本文档将扣除1次下载权益。下载后，不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
6、成为VIP后，您将拥有八大权益，权益包括：VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
7、VIP文档为合作方或网友上传，每下载1次，网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等，对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档

RT-PCR步骤

RT-PCR步骤 RNA提取（-80℃保存）取50-100mg组织加入1ml Trizol，剪碎，振荡30s 转入一新EP管中（1.5ml），室温保存5min 加氯仿0.2ml，振荡混合（手摇剧烈），室温放置5min 12000 rpm 4℃离心15min 转移上层水相（吸70%）到一新EP管中，加异丙醇0.5ml,振荡混合，室温保存10min 12000rpm 4℃ 离心15min 倒掉上清，加1ml 75%无水乙醇（4℃保存），振荡混合，7500rpm 4℃ 离心5min 倒掉上清，室温或37℃放置20min(EP管倒置在滤纸上)使RNA沉淀干燥加20ul DEPC水至EP管中在50℃孵育3-5min(或手握3-5min),使RNA充分溶解注意：操作过程中带手套口罩，所用到的仪器设备须经去除RNA酶处理（灭菌或DEPC水浸泡） RNA短暂离心 RNA模板0.5-2ug,再加入Oligo(dt) 1ul,加DEPC水补齐至10ul.轻轻混合均匀，短时间离心将反应液置于65℃ 5min 冰上1min,短时间离心按顺序加入： 5×buffer 4ul 200ul核糖核苷酸酶抑制剂 0.5ul 10mm dNTP MIX 1ul 逆转录酶 1ul RNase-free H2O 3.5ul 轻轻混合均匀，短时间离心将混合物置于37℃，60min 75℃加热15min,中止上述反应，置于冰上25ul的反应体系，冰上操作，稍后短时间离心 Template 1ul/3ul Primer 1 1ul Primer 2 1ul 10*Taq Buffer 5ul dNTPs(10mM) 1ul Taq酶 1ul ddH2O 补至25ul (9.5ul/7.5ul) 2.PCR循环: ① 94℃ 5min ② 94℃ 45s ③ Tm+4℃ 45s ④ 72℃ 45s 2 29-34 (从第2步开始循环30-35个循环) ⑤ 72℃ 10min ⑥ 4℃ 12h PCR结束后-20℃保存或置于冰上开始电泳退火温度计算 2（A T） 4（G C）正反义平均数，再上下波动度（±4℃，或±5℃）