间接ELISA在检测巴氏杆菌抗体中封闭条件的选择.doc

Vol. 37，N1 研究报告 间接 ELISA 在检测巴氏杆菌抗体中 封闭条件的选择 毛东风，王康英，刘翊中，冯若飞，孙会芳，佟 辉 （ 西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030） 摘要：间接 ELISA 在检测抗体中广泛应用，而封闭作为间接 ELISA 中必不可少的一步可直接影 响试验的准确性。利用巴氏杆菌提取的包被抗原，经方阵滴定法确定抗原和血清的最佳工作浓度为 11 400 和 11 100。而且通过对几种封闭液分别 37C 水浴 2 h 后 4C 24 h、4C 24 h、37C 水浴 3 h 封闭 对比找出最佳的封闭条件为含 0. 5% BSA 2% 蔗糖的 PBS 封闭液在 37C 水浴 2 h 后 4C 24 h。 关键词：间接 ELISA；包被；OD492 - 630 中国图书分类号：S 852. 4 3 文献标识码：A 文章编号：1006—799X（2007）01—0009—03 9 间接 ELISA 是检测抗体最常用的方法， 其原理为利用酶标记的抗体检测已与固相抗 原结合的受检抗体。在间接法血清中非特异 性蛋白含量远超过特异性蛋白，这些非特异 蛋白可以直接吸附于固相上，从而导致阴性 本底值过高，使检测的准确性降低。 而封闭是载体经抗原或抗体经包被后用 大量的无关蛋白填补载体表面未被占据的空 间。封闭和包被类似，但封闭液中蛋白含量 往往较大，一般常用的封闭液为牛血清白蛋 白（ BSA）、小牛血清（ FCS）、脱脂奶粉等。在 夹心 ELISA 中 封 闭 可 以 省 略 掉，但 在 间 接 ELISA 中封闭则是必要的［1］。 1 材料和方法 1. 1 包被抗原和血清 抗原为 EDTA 法提取的巴氏杆菌细胞成 分 ，血 清 为 巴 氏 杆 菌 经 甲 醛 灭 活 后 加 入 Al（ OH）3胶免疫小尾寒羊所得的阳性血清， 收稿日期：2006—05—24 作者简介：毛东风（1981—），河南省柘城县人， 硕士研究生，主要从事动物腹泻病防治方面的研究。 阴性血清为小尾寒羊免疫前采取的血清。 1. 2 其它材料 血清白蛋白（ BSA）、小牛血清（ FCS）、脱 脂奶粉、兔 抗 羊 HRP 标 记 抗 体（ 博 大 泰 克 产）、96 孔 酶 标 板（ 博 大 泰 克 产）、Multiskan 酶标仪（ Thermo 产）、OPD，其它材料均为国 产分析纯。 1. 3 包被抗原的提取并用考马斯亮蓝法测 定蛋白浓度 取培养好的巴氏杆菌血琼脂培养皿［2］， 用含 1% 石炭酸的 PBS 5 mL 洗下菌苔，1 000 X g 离心 15 min，取沉积体悬浮于 10 mL PBS 中。取菌液于血球计数板上计数并调菌液 CFU 为 1010，加入 EDTA 二钠使菌液终浓度 达到 10 mol / L。然后置于 45C 水浴 1 h，随后 晃动 30 min。4 000 X g 离心 30 min，取上清 装入透析袋中于生理盐水中透析 12 h，透析 过的溶液用蔗糖浓缩原体积 1 / 2 。2 000 X g 离心 15 min，取上清用考马斯亮蓝法测定其 蛋白浓度为 1. 41 mg / mL。分装置于 - 20C 保存［3］。 1. 4 方 阵 法 测 定 抗 原 和 血 清 最 佳 工 作 浓 度［4］ 10 甘肃畜牧兽医 2007 年 1（ 总 192）期 以 pH9. 6 的碳酸盐缓冲液将抗原从 1f 根据 1. 4 步骤所测定的最佳工作浓度再 50 稀释至 1 f 3 200，每孔加入 100 !L，37C 水浴 2 1 后 4C 过夜包被。然后用含 0. 5% 吐 温 - 20 的 PBST 液 洗 3 min X 3 次，加 入 含 1% BSA 的 PBS 封闭液 150 !L / 孔，37C 水浴 2 1 后 4C 过夜。PBST 洗 3 min X 3 次。将阳 性血清分别稀释 50、100、200 倍 100 !L / 孔加 入，水浴 2 1，用 PBST 洗 3 min X 3 次。按说 明将标记的兔抗羊血清 1f 1 000 倍稀释，每 孔加入 100 !L，37C 水浴 2 1，PBST 洗 3 min X 3 次。加 入 OPD - H2O2底 物 液 100 !L / 孔，置 于 暗 盒 内 反 应 10 min，用 2 mol / L 的 H2SO4终止液 50 !L / 孔终止后于酶标仪上双 波长测定 OD492 - 630 。每孔均做复孔，取其平 均值［5］。 1. 5 封闭方法选择 用含 1% BSA、10% 小牛