蛋白质的测定方法.doc

天津农学院 职业技术学院毕业论文 题目：有机酸的测定方法及其研究进展 作者：曲洪双 系别：生物工程系 班级：08生物技术 指导教师：童应凯 目录 1.引言（前言） 2. 蛋白质的总量的测定方法 2.1半微量凯氏定氮法（水蒸气蒸馏法） 2.2双缩脲比色法 2.3紫外吸收法 2.4考马斯亮蓝染色法 2.5蛋白氮与非蛋白氮含量的测定 2.6 Folin—酚试剂法Folin—酚试剂法1.原理???蛋白质与碱性铜溶液中的Cu2+络合使得肽键伸展，从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与磷钼酸—磷钨酸反应，生成钼蓝、钨蓝。其蓝色的深浅与蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量成正比，故可作为比色法测定。???该测定法比双缩尿法灵敏，并适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定，对那些含这两个残基与标准蛋白差异较大的蛋白质来说定量有误差。Folin—酚试剂法是检测可溶性蛋白质含量最灵敏的方法之一。本法适宜测定范围25～250ug蛋白质。2.试剂???(1)?Folin—酚试剂甲??40g/L碳酸钠溶液，0.2mol/LNaOH溶液，10g/L硫酸铜溶液，20g/L酒石酸钾钠溶液。????临用前将与等体积混合成碳酸钠—氢氧化钠溶液。与等体积混合成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液。然后这两种试剂按(50+1)的比例混合即成。临用前混合配制，1d内有效。????(2)?Folin—酚试剂乙??称取钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）25g，置入2000mL磨口回流装置内，加水700mL，85%磷酸50mL和浓盐酸100mL。充分混匀，小火回流10h。回流结束后加入硫酸锂（Li2SO4）150g,水50mL及数滴液体溴至溶液呈金黄色，开口继续煮沸15min，以出去多余的溴。冷却后溶液呈金黄色（如仍呈绿色，需再重复滴加液体溴的步骤）。将溶液稀释至1000mL，过滤，置棕色瓶中保存。使用时用水（1+2）稀释。????(3)?标准蛋白质溶液??牛血清蛋白或酪蛋白预先经凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度配制成250ug/mL溶液。????(4)?0.05mol/LpH7.0磷酸缓冲液??称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）1.09g，磷酸二氢钠（Na2HPO4·2H2O）0.31g，溶于80mL水中，用pH计调至pH7.0，然后用水稀释至100mL。3.测定步骤?????绘制标准曲线：取6支干燥洁净的试管编号，按表2-1-1加入试剂。表?2-1-1??????????????????绘制标准曲线所用试剂管号 0 1 2 3 4 5 标准蛋白质溶液 水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Folin-酚试剂甲 ?充分摇匀，室温放置10min。各管加入Folin—酚试剂乙0.5mL，立即摇匀，30min后以0?号管作为空白对照，在650nm波长处测定各管吸光度。以吸光度为纵坐标，标准蛋白质质量（ug）为横坐标绘制标准曲线。????样品制备：称取待测样品2g（准确至1mg）置入研钵中，加入10mLpH7.0磷酸缓冲液，充分匀浆，将匀浆液全部转入离心管中，以5000r/minde?转速离心10min，重复上述操作，再提取2次。将上清液并入25mL容量瓶中，用pH7.0磷酸缓冲液定容至刻度。????样品测定：准确吸取蛋白质提取液0.2mL置干燥试管中，加0.8mL水以下按标准的绘制方法操作。30min后于650nm波长处测定吸光度，在标准曲上查出相应的蛋白质的质量（ug）。4.计算蛋白质含量（mg/g）=m’×1/0.2×V×1/m×1/1000???式中???m’—由标准曲线查得蛋白质的质量（ug）；???????????0.2—吸取试液体积（mL）；????????????V—试液总体积（mL）；???????????m?—称取试样质量（mg）；?????????1000—ug换算成mg。5.讨论????(1)?Folin—酚试剂乙在酸性条件下较稳定，而试剂甲是在碱性条件下于蛋白质作用生成碱性的铜—蛋白质溶液。当试剂乙加入后，应迅速摇匀，使还原反应产生在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前。????(2)?Tris缓冲剂以及蔗糖、硫酸铵、基化合物均可干扰Folin—酚反应。此外，所测的蛋白质样品中，若含有酚类及柠檬酸，均对此反应有干扰作用。而浓度较低的尿素、胍、硫酸钠、硝酸钠、TCA、乙醇、乙醚、丙酮，对显色无影响，但浓度较高时则要校正。如果所测样品中含硫酸铵，需增加碳酸钠—氢氧化钠浓度即可显色测定。若样品酸度较高，也需提高碳酸钠—氢氧化钠量1～2倍，这样即可纠正显色后色浅的弊病。