论鸡蛋白提取液对体外培养干细胞蛋白的影响.docVIP

论鸡蛋白提取液对体外培养干细胞蛋白的影响 　　有文献报道动物的卵细胞提取液能重新编程体细胞，包括猪的卵细胞[1]和非洲爪蟾的卵细胞[2,3]提取液都能使体细胞核重编程。在这个研究中，我们用鸡蛋白提取液作用于不同细胞，共培养3d后，收集细胞，送公司做干细胞蛋白芯片检测，现将研究报道如下。　　1材料与方法　　1.1细胞来源　　4种细胞为我们实验室经常培养的细胞，C57小鼠的骨髓间充质干细胞(C57-BMSC)(自己制备),树鼩的脐带间充质干细胞(TS-UC-MSC)(自己制备),293T细胞(购自中国科学院昆明细胞库)和GFP慢病毒转染成功的293T细胞(293T-GFP)(自己转染成功).　　1.2鸡卵清提取液的制备　　取几个鸡卵，无菌分离卵清和卵黄，卵清按1∶1加裂解液，充分搅匀，存放于-20℃。冻融3次后，离心，取上清，4℃保存。裂解液配方：50mmol/LNaCl,5mmol/LMgCl2,100mmol/LHEPES,pH8.2,1mmol/L二硫苏糖醇(DTT),0.1mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)和蛋白酶抑制剂。由此得到的提取液为鸡卵清提取液。获得的提取液用50%的终浓度与293T细胞共培养3d,然后用定量PCR的方法检测细胞多能基因OCT4和NANOG与对照(培养基培养)相比明显升高，即为质控指标合格，可用于下面的实验。　　1.3干细胞蛋白芯片检测步骤　　每个芯片孔中加入100μl的1×封闭液，室温摇床上孵育30min,避免产生气泡;抽去封闭液，每个孔中添加100μl样品，一个阵列一个样品;4℃振荡过夜孵育。使用ThermoScientificWellwashVersa芯片洗板机清洗玻片，每孔加入70μl生物素标记抗体;室温震荡孵育1~2h,清洗，每孔加入70μl的1500倍稀释的荧光剂-链霉亲和素，用密封条贴住玻片，然后用铝箔纸包住玻片避光室温震荡孵育1~2h.清洗，采用激光扫描仪例如AxonGenePix扫描信号。采用芯片分析软件提取数据，对于Foldchange,选取大于1.5为有统计学意义。　　1.4Westernblot检测多能标志　　蛋白OCT4和NANOG兔抗人OCT4多克隆抗体购自Immunoa-way公司，鼠抗人NANOG单克隆抗体购自Millipore公司，二抗均购自碧云天生物技术有限公司。293T细胞在6孔板中，一孔加培养基，一孔加50%终浓度的鸡蛋白提取液，共培养3d后，用碧云天的IP细胞裂解液提细胞蛋白，取50μl细胞蛋白液加10μl6×的上样缓冲液，100℃水浴5min,上样20μl,进行SDS电泳，电泳结束后，100v电压转膜1h,膜用5%脱脂奶粉的TBS封闭37℃1h,将一抗1∶250稀释于2%脱脂奶粉的TBS中，37℃振摇1h,TTBS洗3次，每次5min,二抗1∶200稀释于2%脱脂奶粉的TBS中，37℃振摇1h,TTBS洗3次，每次5min,ECL显色，用Tanon的化学发光成像仪检测发光条带。　　2结果　　2.1C57-BMSC有3个蛋白发生了统计学意义的改变SOX17、BMPR-1A和NANOG是干细胞中表达的蛋白，当体细胞向干细胞转变后细胞中这几个蛋白的表达升高，我们用50%终浓度的鸡蛋白提取液与C57-BMSC共培养3d后，这几个蛋白的表达明显升高，说明C57-BMSC又向更多能的干细胞分化了，见图1.　　2.2TS-UC-MSC有1个蛋白发生了统计学意义的改变BMPR-1A是干细胞多能性的标志，TS-UC-MSC用50%鸡蛋白提取液共培养3d后，与未加鸡蛋白提取液培养的细胞相比，BMPR-1A明显升高，说明细胞又向多能干细胞的方向分化了，见图2.　　2.3293T有1个蛋白发生了统计学意义的改变BMPR-1A是干细胞多能性的标志，293T细胞是标准的体细胞株，用50%鸡蛋白提取液共培养3d后，BMPR-1A表达明显升高，说明293T细胞有向干细胞转变的现象发生，见图3.　　2.4293T-GFP有1个蛋白发生了统计学意义的改变OCT4是干细胞多能性的标志，293T-GFP用50%的鸡蛋白提取液共培养后，对比培养基培养的细胞OCT4的表达明显增加，说明细胞有向干细胞转化的现象。　　2.5293T细胞OCT4和NANOG蛋白的Westernblot结果(图5)OCT4和NANOG蛋白是干细胞多能性的标志，293T细胞用50%的鸡蛋白提取液共培养后，OCT4和NANOG蛋白的表达量明显增加(图5和表1),与对照组(培养基培养)相比有统计学意义(Plt;0.05,n=3).　　3讨论　　SOX17、BMPR-1A、NANOG和OCT4是干细胞中表达的蛋白，在细胞转化为多能的干细胞时，这几个蛋白的表达明显升高。因此，这些蛋白在细胞中表达明显升高时，可以认为细胞向多能