第二章基因工程制药.ppt

七、基因工程制药实例 1. 干扰素2. GM-CSF3. 人白细胞介素-2 一、医药生物技术产品质量保证的一般性要点 3. 严格控制条件 宿主细胞中表达的天然基因，转录或翻译后，或精制、工艺放大过 程中，都有可能发生变化，故从原料到制成品制备全过程的每一步都 须严格控制条件与鉴定质量，确保符合标准规格、安全有效。 二、生物材料的质量控制 原材料的质量控制是要确保编码药品的DNA序列的正确性， 重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的 安全性和一致性，所以原材料的质量控制主要是对目的基因、表达 载体以及宿主细胞的检查。 1.目的基因 根据指控要求，需明确目的基因的来源、克隆经过；对于改造 过的基因应说明被修改的密码子、被切除的肽段及拼接的方法； 使用PCR技术扩增得到的基因，应说明扩增的模板、引物及酶反应 条件等情况，并以限制性内切酶酶切图谱和核苷酸序列等分析方法 确证基因结构的正确无误。 二、生物材料的质量控制 2. 表达载体 应提供表达载体的名称、结构、遗传特性及其各组成部分(如复制 子、启动子)的来源与功能，构建中所用位点的酶切图谱，抗生素抗性 标记物等。 二、生物材料的质量控制 3.宿主细胞 应提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其 生物学特性等；需阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主 细胞内的状态，是否整合到染色体内及拷贝数，并证明宿主细 胞与载体结合后的遗传稳定性；提供插入基因与表达载体两侧 端控制区内的核苷酸序列，详细叙述在生产过程中，启动与控 制克隆基因在宿主细胞中表达的方法及水平。 二、生物材料的质量控制 在贮存中，要求种子克隆纯而稳定；在培养过积中，要求质粒稳定，始终无突变；重复生产发酵中，工程菌表达稳定；始终能排除外源微生物污染。 三、培养过程的质量控制 1.生产用细胞库 需证明种子批不含致癌因子，无细菌、病毒、霉菌和支原体等污 染，由原始种子批建生产用工作细胞库。 在同一实验室工作区内，不得同时操作两种不同的细胞或菌种， 一个工作人员也不得同时操作两种不同的细胞或菌种。 建原始种子批须确证克隆基因DNA序列，详细叙述种子批来源、 方式、保存及预计使用期，保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性。 对生产种子，应详细叙述细胞生长与产品生成的方法和材料，并 控制微生物污染；提供培养生产浓度与产量恒定性数据，依据宿主细胞 /载体系统稳定性确定最高允许传种代数。 三、培养过程的质量控制 2.培养过程 培养过程中，应测定被表达基因分子的完整性及宿主细胞 长期培养后的基因型特征； 依宿主细胞/载体稳定性与产品恒定性，规定持续培养时间， 并定期评价细胞系统和产品。 培养周期结束时，应监测宿主细胞/载体系统的特性。 三、培养过程的质量控制 分离纯化过程中，常用分级沉淀、超滤、电泳和色谱等技术，其质量控制要求能保证去除微量DNA、糖类、残余宿主蛋白质、纯化过程带入的有害化学物质及热原质，或者将这类杂质都控制在规定限度以下。 四、纯化过程的质量控制 纯化工艺的每一步完成后均应测定收获物纯度，计算提纯倍数、收获率等，要对每一步的纯化效率、活性回收率和蛋白回收率进行检测。 要明确使用的纯化方法的原理、目的以及预期的去除杂质的效果，在不同纯化步骤中能去除不同性质的杂质，并进行相应的工艺验证。 纯化方法的设计应考虑到尽量去除污染病毒、核酸、宿主细胞杂蛋白、糖以及纯化过程带入的其他有害物质。 纯化工艺过程中应尽量不加入对人体有害的物质。 四、纯化过程的质量控制 如用柱层析技术应提供所用填料的质量认证证明，并证实从柱上 不会掉下有害物质。 上样前应清洗除去热原质等。 若用亲和层析技术，不应含有可测出的异种免疫球蛋白。 如在反相纯化步骤中用到乙腈或甲醇等有机溶剂，用Protein A亲 和层析纯化抗体，有机溶剂和Protein A等这些对人体有害的物质应加 以去除和控制。 四、纯化过程的质量控制 基因工程药物质量控制主要包括以下几项要求： 产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。 需要综合利用生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学 和分子生物学等多门学科的理论与技术，保证基因工程药品的 安全有效。 五、目的产品的质量控制 1．生物活性测定 多