毛霉的分离和豆腐乳的制备.doc

09食品（1）班 卓凯 200924103134 毛霉的分离和豆腐乳的制备 实验目的： 学习毛霉的分离和纯化方法。 学习毛霉菌种的扩大培养过程及技术。 ?掌握豆腐乳发酵的工艺过程。 观察豆腐乳发酵过程中的变化。 实验原理： 毛霉又叫黑霉、长毛霉。菌丝为无隔膜的单细胞，多核，以孢囊孢子和接合孢子繁殖。毛霉的菌丝体在基质上或基质内能广泛蔓延，有假根和匍匐枝，孢囊梗直接由菌丝体生出，一般单生，分枝较少或不分枝。分枝顶端都有膨大的孢子囊，囊轴与孢囊梗相连处无囊托。孢囊孢子成熟后，孢子囊壁破裂，孢囊孢子分散开来。毛霉菌丝初期白色，后灰白色至黑色，这说明孢子囊大量成熟。 毛霉在土壤、粪便、禾草及空气等环境中存在。毛霉的代谢类型是异养需氧型.在高温、高湿度以及通风不良的条件下生长良好。毛霉的用途很广，常出现在酒药中，能糖化淀粉并能生成少量乙醇，产生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力，我国多用来做豆腐乳、豆豉。许多毛霉能产生草酸、乳酸、琥珀酸及甘油等，有的毛霉能产生脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等。常用的毛霉主要有鲁氏毛霉和总状毛霉。 毛霉腐乳：以豆腐坯培养毛霉，进行发酵，使白色菌丝长满豆腐坯表面，形成坚韧皮膜，积累蛋白酶，为腌制装坛后期发酵创造条件。 毛霉的分离与纯化：在无菌操作的条件下称取25克长满毛霉菌丝的豆腐坯，放入盛有225毫升无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，摇匀，制成孢子悬液，用接种环取该孢子悬液在PDA平板表面作划线分离，于20度培养1~2d，以获取单菌落，同时将细胞涂片，镜检是否为单一的毛霉细胞，若发现有杂菌，须再次进行分离与纯化，直到获得纯培养。 豆腐乳是我国独特的传统发酵食品，是用豆腐发酵制成。民间老法生产豆腐乳均为自然发酵，现代酿造厂多采用蛋白酶活性高的鲁氏毛霉或根霉发酵。豆腐坯上接种毛霉，经过培养繁殖，分泌蛋白酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶等复杂酶系，在长时间后发酵中与淹坯调料中的酶系、酵母、细菌等协同作用，使腐乳坯蛋白质缓慢水解，生成多种氨基酸，加之由微生物代谢产生的各种有机酸，与醇类作用生成酯，形成细腻、鲜香等豆腐乳特色。 实验器材 菌种：腐乳毛霉 培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），豆渣，麸皮培养基 无菌水、培养皿、250ml三角烧瓶、接种环、铲、接种针、小笼格、喷枪、小刀、带盖广口玻瓶、显微镜、恒温培养箱等 流程 毛霉斜面菌种 → 扩大培养 → 孢子悬浮液 ↓喷洒 豆腐 → 豆腐坯 → 接种 → 晾花 → 加盐 → 腌坯 → 装瓶 → 后熟 → 成品 1.毛霉的分离 配制培养基 → 毛霉分离 → 观察菌落 → 显微镜检 2.豆腐乳的制备 悬液制备 → 接种孢子 → 培养与晾花 → 装瓶与压坯 → 装坛发酵 → 感官鉴定 实验步骤及技术操作 毛霉分离 1.1制备培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），经配制、灭菌后倒平板备用。 1.2毛霉的分离 在无菌操作的条件下称取25克长满毛霉菌丝的豆腐坯，放入盛有225毫升无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，摇匀，制成孢子悬液，用接种环取该孢子悬液在PDA平板表面作划线分离，于20度培养1~2d，以获取单菌落。 1.3初步鉴定 （1）菌落观察 呈白色棉絮状，菌丝发达。 （2）显微镜检 于载玻片上加1滴石碳酸液，用解剖针从菌落边缘挑取少量菌丝于载玻片上，轻轻将菌丝体分开，加盖玻片，于显微镜下观察孢子囊、梗的着生情况。若无假根和匍匐菌丝、或菌丝不发达，孢囊梗直接由菌丝长出，单生或分枝，则可初步确定为毛霉。 纯的母种试管种的制备 2.1制备培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），经配制、分装于试管中、灭菌后、搁置斜面备用 2.2制备纯母种 挑取毛霉单个菌落接入斜面培养基，于25℃下培养3天。 菌种的三角瓶扩大培养 3.1豆渣、麸皮培养基的配制 将豆渣、麸皮以3：1或者2：1的比例和水分60%或以上搅匀。装入三角瓶，装1~2厘米的瓶高度即可且要疏松。然后把瓶口洗干净，塞好棉花塞，用纸包扎好。在121摄氏度下灭菌40分钟。 3.2接种 灭菌后要待包扎瓶口的纸干燥后并且要使温度下降到15摄氏度以下才可接种。灭菌后的基料变实，应打散培养基，然后加半匙的试管菌种进去，用接种钩搅匀培养基料和孢子粉。 3.3培养 在225摄氏度下培养2天，温度不可过高。培养至菌丝和孢子生长旺盛，备用。 豆腐乳的制备 4.1孢子悬液的制备 于上述三角瓶中加入无菌水200mL，用玻璃棒搅碎菌丝，用无菌双层纱布过滤，滤渣倒回三角瓶，再加200 mL无菌水洗涤1次，合并滤液于第一次滤液中，装入喷枪贮液瓶中供接种使用。 4.2接种孢子 用刀将豆腐坯划成4.1cm×4.1cm×1.6cm的块，将笼格经蒸汽消毒、冷却，用孢子悬液喷洒笼格内壁，然后把划