基因工程抗体gaobo141016.pptVIP

* 双特异性抗体 * 1. 高效的表达、筛选抗体的体系 将表型（与抗原特异结合）和基因型（含有片段抗体基因）联系起来，使识别抗原的能力与进行再扩增的能力结合在一起，可以模拟生物体内B细胞的有关特性—识别与扩增的统一。 2. 绕过免疫制备全人源性抗体，避免了鼠源性抗体在人体 应用时诱发的HAMA等不良反应。 噬菌体抗体库技术的出现及噬菌体抗体的研制成功已成为生命科学研究的突破性进展之一。 噬菌体抗体 特 色 * 以噬菌体为载体，将抗体基因(Fab或ScFv基因等)与噬菌体编码的外壳蛋白Ⅲ(cpⅢ)或Ⅷ(cpⅧ)相连，在噬菌体表面以抗体-外壳蛋白融合蛋白的形式表达； 经辅助病毒感染后，借助cpⅢ的信号肽穿膜作用，进入宿主外周基质，在正确折叠后被包装于噬菌体尾部，随后携带有表达载体的宿主菌就会释放出带有抗体片段的噬菌体颗粒； 这种噬菌体抗体可以特异识别抗原，又能感染宿主菌进行再扩增； 采用类似于亲和层析原理从噬菌体抗体库中筛选出特异性抗体。 噬菌体抗体 基本原理 * 1 Insert Fab genes into phages 2 Infected bacteria make new phages 3 Screen the phages specific to the antigen 4 Add the selected phages back to bacteria 5 Put the Fab onto Ab backbones Phage-displace can be used instead of hybridomas 噬菌体抗体 * 噬菌体抗体的克隆和表达 antigen antigen Repertoire of diverse sequences displayed on phage Incubation of phage-displayed repertoire with antigen Elimination of unbound phage Elution of bound phage Selection of ligands from phage-display libraries * 噬菌体抗体库技术的产生主要依赖于三项实验技术的发展： 1. PCR技术的发展使人们可以用一组引物克隆出全套Ig 的可变区基因。目前已设计出了多套扩增VH和VL基 因的引物。 2. 从大肠杆菌内分泌有结合功能的Ig分子片段获得成 功。这一成功说明了用抗体库在原核细胞筛选特异 性抗体的可行性。 噬菌体抗体 * 3. 有效的筛选系统（噬菌体表面表达技术）的建立 将肽链通过与单链噬菌体外壳蛋白（pⅢ或pⅧ）融合表达在丝状噬菌体（fd、M13）的表面，利用其可以再扩增的特性，将靶分子固定化，通过亲和筛选-洗脱-扩增，可筛选到靶分子的配体肽链或Fab段。 两种丝状噬菌体呈现系统，外壳蛋白 cpIII系统及cpVII系统。 其中cpVIII系统是一种多价选择系统,可同时呈现多达2O00拷贝/噬菌体的多拷贝结合蛋白，因而可以大大提高亲和力较低的抗体片段的整体亲和性，更有利于筛选得到阳性克隆 cpIII产物仅约4拷贝／噬菌体，为单价选择系统，因而筛选获得的抗体亲和力一般较高。 噬菌体抗体 * 筛选技术的发展 筛选抗细胞表面抗原抗体 抗原阴性细胞（antigen-negative cell）作为非特异性噬菌体的吸附体 e.g.以人血细胞Rh(D)+为靶细胞，Rh(D)-为非特异性噬菌体吸附体，从而成功地从Fab噬菌体抗体库中筛选出一系列的抗Rh(D)抗体。 噬菌体抗体的克隆和表达 * 高亲和力抗体的获得 1. 模拟体内亲和力成熟的过程 定点突变、模拟体内过程，先造成大量的随机突变，再经抗原选择、在致突变株体内进行突变、半随机突变法 2. 链更替 固定VH基因而置换选择VL基因 选出匹配最好的高亲和力的VH—VL组合(亲和力提高20倍) 固定H3—VL基因而置换选择H1一H2基因(亲和力提高15倍) 将H1一H2节段(库)与单一H3-VL基因连接(不用接头) 噬菌体抗体的克隆和表达 * 高亲和力抗体的获得 3. 增加抗体库的多样性 联合感染技术(combinatorial infection) 增加链组合 105不同的轻链、107不同的重链，用联合感染技术，经Cox P位点使两链在体外有效地组合在同一噬菌体中，这就可以直接分离获得库容量为1012的高亲和力抗体； 提高噬菌粒的包装滴度和提高细菌的转化效率、构建载体时酶切位点的合理选择，以及PCR引物的设计等进