25生物化学实验--大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化.doc

大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化 【目的】 1. 掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验方法和技术。 2. 熟悉大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验原理。 【原理】 1. 大肠杆菌感受态细胞的制备、转化原理 细菌的生物学特性由于吸收外源 DNA 发生可遗传的改变叫转化，在基因克隆技术中，转化（ transformation ）特指以质粒 DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。转染（ transfection ）是指噬菌体、病毒或以它为载体构建的重组子导入细胞的过程。未经特殊处理的宿主细胞较难进行转化，细菌处于容易吸收外源 DNA 的状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。重组 DNA 转化细菌的技术操作关键就是通过一定的方法，人工诱导细菌进入一个敏感的感受态，以便外源 DNA 进入细胞内。 本实验采用氯化钙溶液处理对数生长期的 E.coli. DH-5α 细胞 , 使 E.coli. DH-5α 细胞的通透性增加，摄取外来 DNA （本实验中的质粒 DNA 为 pUC-18 ）能力增加，其原理为当细菌处于 0 ℃ ， CaCl 2 低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNAase 的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42℃ 短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达。 2. 转化大肠杆菌的筛选 由于 pUC-18 （如图）含有 Amp r （氨苄青霉素抗性）基因便具有在含 Amp 培养基上生长的能力，形成单个菌落，而未转入 pUC-18 的 E.coli. DH-5α 细胞，不具有 Amp r 基因，在含 Amp 的培养基中，生长受到抑制，不能形成肉眼可见的菌落，从而使转化和未转化宿主细胞得以区分开来。进一步将转化菌涂布在含 IPTG 和 X-gal 的 LB 平板上，由于 pUC-18 还带有一段大肠杆菌 β- 半乳糖苷酶基因（ lacZ ）的启动子及其编码 α- 片段的 DNA 序列，此结构成为 lacZ ＇基因，在 lacZ ＇基因中的靠近 5 ＇端有一段多克隆位点（ MCS ）， 而大肠杆菌含有 β- 半乳糖苷酶 ω 片段的编码基因，尽管载体和宿主编码的这两个片段都没有活性，但两者同时存在时能够融为一体，形成具有酶活性的蛋白质，这样 lacZ 基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为 α- 互补。由 α- 互补而产生的 LacZ + 细菌在诱导剂 IPTG 的作用下，在生色底物 X-gal 存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源 DNA 插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无 α- 互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。 图 23-1 质粒 pUC18 图谱 图 23-2 质粒 pUC18 酶切图谱 【器材】 ? 高速温控离心机 ? 超净工作台 ? 恒温水浴箱 ? 10ml 离心管、 1.5m 1EP 管 ? 培养皿（ φ 9cm ） ? 酒精灯 ? 推子 ? 摇床 ? 可调微量移液器 ? 10ml 试管、 100ml 三角瓶 ? 恒温培养箱 ? 0.45μm 、 0.22μm 滤膜 ? 封口膜 【试剂】 1 ． E.coli. DH-5α 菌种 2 ． pUC-18 质粒（ 0.5μg/μl ） 3 ． LB （ Luria-Bertani ）液体培养基：细菌培养用胰化蛋白胨（ bacto-tryptone ） 10g 、细菌培养用酵母抽提物（ bacto-yeast extract ） 5g 、 NaCl 10g 、加去离子水至 800ml ，搅拌，使溶质完全溶解。用 5mol/L NaOH （约 0.2ml ）调节 pH 值至 7.4 ，加去离子水至总体积为 1L ，以 1.034×10 5 Pa 高压蒸气灭菌 20 分钟。 4 ． LB 固体培养基 上述 LB 液体培养基中按 15g /L 加入细菌培养用琼脂（ bacto-agar ），以 1.034×10 5 Pa 高压灭菌 20 分钟。溶液尚未冷却时，即应取出培养基，并轻轻转动以使溶解的琼脂均匀分布于整个培养基溶液中。 5 ． 0.1mol/L CaCl 2 溶液 用蒸馏水溶解 11 g 的 CaCl 2 ，定容至 1000 ml ， 1.034×10 5 Pa ，高压灭菌 20 分钟， -20℃ 保存。 6 ．氨苄青霉素（ Amp ）溶液 取未开封氨苄青霉素粉 0.5g ，加入灭菌蒸馏水 5m 1