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植物可食用疫苗的研究进展 （河北科技大学生物科学与工程学院 万阳芳 050018） 摘要：转基因技术在植物可食用疫苗中的应用，主要原理与技术，主要应用外源基因，主要研究成果。 关键词：转基因，外源基因，植物，可食用疫苗 疫苗是现代人不可缺少的防御疾病的活性物质，它神奇的作用从一开始就注定了它在日常生活中的重要角色。随着人们对它研究的深入，人们对它的要求也越来越高。由于现在人们对食品药品的空前关注，使得研究人员开始考虑怎样使人们只是通过日常生活的饮食就可以得到很好的免疫效果。食用疫苗正是他们正在研究和尝试的新型生物技术。转基因植物技术是随着DNA重组基因的遗传转化植物的组织培养目的基因的整合与表达的检测等技术手段的建立而发展起来的生物技术。利用转基因植物作为生物反应器，将外源基因引入植物内，以生产药用多肽和医用疫苗，这是继转基因动物之后新兴的研究领域。将机体的免疫机理与植物DNA重组技术相结合，生产出能够使人体获得特异抗病能力的可食用疫苗【1】。 1 主要原理与技术【2】 研究证实,当植物表达细菌或病毒等病原体的抗原基因时,所表达蛋白保留自然状态的免疫原性;食用这些转基因食物时,可刺激机体体液和黏膜免疫应答。这两点是转基因植物生产重组疫苗的理论依据〔3〕。转基因植物生产可食用疫苗的关键在于植物转基因技术,又称植物遗传操作、植物遗传工程(plant genetic engineering) ,主要包括目的基因的分离和克隆、载体的构建、目的基因的转化以及转入基因的表达和分析等。 1.1 　目的基因的分离与克隆　 利用转基因植物生产可食用疫苗首先应筛选并分离待表达的目的基因。可利用基因芯片技术、基因文库技术、功能蛋白组技术、PCR 技术、Mrna 差别显示技术、插入突变、图位克隆等技术和方法分离克隆目的基因。随着PCR 技术的发展完善,目前多采用PCR 方法获得目的基因,对于RNA 病毒则多采用RT- PCR 技术。最近又出新了一些基因分离克隆新技术,如:基因表达系列分析(SAGE) 、代表性差异分析(RDA) 、差减杂交(SH) 与抑制性差减杂交(SSH) 等。 目的基因的转化　 为了在植物中表达特异的蛋白产物,编码该蛋白的基因必须插入到植物细胞的染色体中。植物遗传转化的方法大体可分为两类。一类是载体介导的转化,另一类是外源DNA 直接导入细胞的转化方法。 载体介导的转化　 目前,在植物遗传工程中使用的载体主要包括农杆菌、植物病毒和转座子等,最近几年,通过农杆菌介导的病毒侵染等方法已经成功的使农杆菌侵染禾本科植物。Grimsley 等首次以玉米为材料,用农杆菌将玉米条纹病毒的cNDA 导入玉米细胞;Hiei 等用含有gus/ hpt 质粒的根癌农杆菌与水稻茎间分生组织、悬浮系、幼胚盾片以及愈伤组织等共培养,得到了转化的再生植株。植物病毒也可指导蛋白质的表达,且不需要对寄主植物进行基因修饰。由于病毒增值速度快、表达量高、能侵染单子叶等农杆菌的非寄生植物、基因组小、易于操作、病毒不会通过花粉和种子传播,因此,植物病毒作载体也是1 个较好的选择。花椰菜花叶病毒(CaMV)的和豇豆花叶病毒(CPMV) 、烟草花叶病毒(TMV) 、马铃薯X 病毒(PVX) 等十几种植物病毒已被改造为有效的植物遗传工程载体。 DNA 直接导入的转化 DNA 直接导入的转化是指不经载体而直接将特殊处理的DNA 导入植物细胞中的转化方法。此类方法的最大优点在于它不受农杆菌或病毒寄主范围的限制。DNA 直接导入法用的最多的植物材料是原生质体。80 年代以来,植物原生质体培养及再生技术的迅猛发展为利用原生质体进行农作物的基因工程操作奠定了基础。这类方法包括:脂质体介导法、基因枪法、PEG法、电激法、花粉管通道法和显微注射等方法。其中PEG法和电激法应用较普遍,是国际公认的较成熟的转化方法。最近几年,基因枪法也有了较快的发展。 转基因植物的检测　 目的基因导入植物细胞后,必须要证明其能够整合进入受体植物材料的基因组中,并要检测目的基因是否能够表达。检测转基因植物有许多方法,其中最简单的方法是使用所谓的报告基因,目前常用的报告基因有卡那霉素抗性基因(NPTⅡ) ,胭脂碱和章鱼碱合成酶基因,氯霉素乙酰转移酶基因(CAT 基因) 和β- 葡萄糖苷酸酶基因(GUS 基因) 等。这些基因由于检测灵敏方便,在大多数植物中背景小而得到广泛的应用。另外还可应用Southern 杂交分析、Northern 点杂交、Western 印迹分析等杂交检测法对转基因植物进行检测。此外,一些新的分析手段和方法不断出现。限制性片断长度多型性分析(RFLP) 、随机扩增多型性DNA 分析(RAPD) 、DNA 指纹(DNA fingerprinting) 技术、ribozyme、基因标签(gene