生物技术实验..docVIP

《生物技术实验》 2016年6月29日 目 录 实验1、从动物组织中提取基因组DNA 实验2、PCR扩增基因特异片段 实验3、DNA片段的回收及纯化 实验4、PCR产物的TA克隆 实验5、感受态大肠杆菌细胞的制备（CaCL2法）与质粒转化 实验6、PCR法快速鉴定重组载体（菌落鉴定） 实验7、质粒的提取和纯化 实验8、质粒DNA的电泳和纯度检测 实验9、限制性内切酶酶切法鉴定重组质粒 实验10、外源基因表达载体的克隆 实验11、外源基因在大肠杆菌中的表达 实验12、目标蛋白的PAGE检测 实验13、RNA的提取及其纯度检测 实验14、逆转录PCR（RT-PCR）扩增基因特异片段 实验1、从动物组织中提取基因组DNA （一）实验目的 通过实验掌握基本原理和基本方法实验原理μl RNaseA(10μg/μl),37℃保温30min，用苯酚抽提后，按步骤9和10重沉淀DNA。 （五）注意事项 要充分除去DNA提取液中的苯酚，否则会影响以后的操作。 用酚-氯仿-异戊醇（体积比为25：24：1）抽提后取上清是不能将中间的蛋白质扰动，以防蛋白质污染。 酚-氯仿-异戊醇中的异戊醇是用来消除实验中可能产生的泡沫。 抽提每一步用力要柔和，防止机械剪切力对DNA的损伤。取上层清液时，注意不要吸起中间的蛋白质层。乙醇漂洗去乙醇时，不要荡起DNA。离心后，不要晃动离心管，拿管要稳，斜面朝外。n-1，考虑到扩增效率不可能达到100％，实际上要少些，通常经25～30次循环可扩增106倍，这个量足够分子生物学研究的一般要求。 1 PCR引物设计 (1) Tm值 Tm值是PCR引物设计中的一个重要参数，是指引物与模板之间精确互补并且在模板过量的情况下有50％的引物与模板配对，而另外50％的引物处于解离状态时的温度，Tm值一般高于55℃。合适的引物选择应需考虑到以下因素，如Taq酶的最适温度(TE)和Tm值等。最常用的Taq酶的最适温度(TE)范围为70～74℃，根据TE可以先确定一个合适的退火温度范围(Ta)。这个温度范围应不高于酶的最适反应温度，也不能比TE－25℃更低。这是因为如果退火温度低于酶的最适反应温度时，酶的合成反应会非常缓慢，但片面考虑提高温度又会造成引物脱落而不能进行PCR扩增。所以Ta的选择应满足TE-25℃TaTE。 (2)引物的长度 引物长度一般在15～30个核苷酸之间比较合适。引物过短时造成Tm值过低，不能与模板很好地配对或是配对专一性很低。引物过长时又会造成Tm值过高，超过酶的最适反应温度，还使合成引物的费用大大增加。当然若要在引物的5＇末端加上特定的酶切位点等碱基则可稍长。 (3)引物的GC％含量 引物的GC比最好设计在40％～60％的范围内。GC比过高与过低都会直接造成Tm值的过高与过低。如上所述，Tm值的估计可简单地根据经验式Tm＝4×GC+2×AT+3.3℃获得。 (4)引物3′端起始碱基 Taq酶在3′末端错配时延伸效率是不一样的，延伸效率为TG＝CA。即当引物3′末端为A时，即使有错配碱基也最不易延伸，所以引物设计时可将3′末端设计为A，以提高复制精确性。另一种理论是3′末端应设计为G或C，因为G和C的氢键多于A与T，能更好地与模板结合开始DNA合成，当然对错配延伸效率方面就不能苛求了。总而言之，引物的3′末端不要考虑使用T。 (5)引物无发卡结构 引物自身应无发卡结构。 (6)二引物自身之间不能配对 二引物自身不能配对是指同一对引物之间不能有配对的多个碱基，特别是在引物的3′末端。二引物间不能配对的道理与二引物本身不能配对相同，若发生这种情况会形成引物二聚体，造成扩增失败。一般引物自身配对形成茎环结构，茎的碱基对数不大于3，两条引物间配对碱基数小于5个。 (7)二引物的Tm值 引物设计时应注意使二引物的Tm值相近，否则二个引物必然不能同时达到最佳退火温度，将会影响PCR扩增效果。能同时达到最佳退火温度，将会影响PCR扩增效果。由于影响引物设计的因素比较多，所以常利用计算机来辅助设计，通常可用primer 5.0软件或其它PCR引物设计程序来帮助设计。 2 PCR反应条件 1．PCR缓冲液 常用的1×PCR缓冲液为10mmol／L Tris-HCl pH8.3(常温)，50mmol／L KCl，1.5mmol／L MgCl2。由试剂公司与Taq酶一起提供。 (1)Mg2+离子浓度：Mg2+离子浓度对PCR反应影响很大，因为[Mg2+]与引物-模板及产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的生成、产物的忠实性、酶活力、产物的产量等诸多因素有关。Mg2+一般使用浓度为0.5～2.5mmol／L，必要时可以0.5