耐逆的腈水解酶等化工酶在芽孢表面固定化并优化其连接肽提高固定化效果..docxVIP

摘要腈水解酶作为一种重要的工业酶能够直接将有毒腈化物转化为相应的无毒酸和氨，应用广泛。腈水解酶介导的生物催化制备某些羧酸化合物已经代替了传统的化学合成法，其反应条件温和，环境友好，选择性高等优点，引起研究者密切关注，因此筛选获得更多具有优良性质的腈水解酶具有很大的意义。近年，枯草杆菌孢子展示技术作为一种新型的蛋白固定化方式引起广泛关注，由于枯草杆菌芽孢具有高稳定性和抗逆性，使得芽孢便成为了一个优秀的固定化载体在其表面展示外源蛋白。目前有关利用芽孢展示技术进行耐逆化工酶酶的固定化报道较少，本文首次克隆表达鉴定了来自Thermotoga maritima MSB8的腈水解酶并展示在芽孢表面，然后对连接孢子表面衣壳蛋白与腈水解酶的连接肽进行了初步优化。本研究中，首次从Thermotoga maritima MSB8基因组扩增到腈水解酶基因，并连接到原核表达载体PET-28a上，构建表达质粒PET-28a-nit，然后转化入大肠杆菌BL21，IPTG诱导表达后经SDS鉴定，分子量在30kDa 左右，与预测一致。对Thermotoga maritima MSB8腈水解酶的酶学性质进行了研究，发现以3-氰基吡啶作为反应底物时，该腈水解酶的最适反应温度和pH分别为45℃ 和7.5。热耐受性试验显示在75℃环境下处理0.5h能够保留将近50% 的酶活，酸碱耐受性试验显示该腈水解酶对碱性反应条件的比较敏感。Mn2+，Zn2+和 Cu2+ 能显著抑制酶活，Mg2+ 和Fe2+.能够稍微促进酶活，其它的一些金属离子和金属离子螯合剂EDTA对酶活没有显著影响。还原剂二硫苏糖醇DTT能够一定程度促进酶活，其它一些还原剂、表面活性剂、蛋白酶抑制剂和有机溶剂都对该腈水解酶活性产生了不同程度的抑制作用。该腈水解酶的动力学常数Vm和Km值分别为3.12 μmol/min/mg和7.63mM，催化常数为kcat/Km为0.44 /mM/s，底物谱研究表明该腈水解酶对脂肪族双腈具有明显的特异性。本研究以枯草杆菌芽孢作为酶的固定化载体展示腈水解酶，我们构了建E. coli– B. subtilis穿梭表达质粒pHS-CotG-nit，通过western blot分析和蛋白酶处理，结果证明融合蛋白成功展示在枯草芽孢杆菌孢子表面，即完成了固定化。展示后的腈水解酶最适反应温度和pH分别为50℃ 和 pH 8.0，比游离的腈水解酶要高，展示后的腈水解酶在 75℃和 pH 8.0处理1h后残留的活力分别为79% 和97%，而相应游离腈水解酶只残留32% 和52%的活力，重复利用试验结果表明使用5次循环后可以保留高达83%的活性。本研究初步探究了不同连接肽对孢子展示腈水解酶的影响。结果显示含有连接肽L0、L3、L4、L4、L5、L6、L9展示腈水解酶最适反应温度和pH分别为45℃和7.5，L2、L7、L10、L11为50℃和8.0，L8为55℃和8.5，在85℃处理3h L8残留活性最高为19.5%，无连接肽的L0残留活性为7.3%，前者将近是后者的3倍，热稳定最好的连接肽为L8： GGGGSEAAAKGGGGS。在pH9.0处理3h L8残留活性最高为21.5%，无连接肽的L0为11.3%，前者将近是后者的2倍，碱稳定性最好的连接肽也是L8：GGGGSEAAAKGGGGS。在1mM 的二硫苏糖醇DTT，1% v/v SDS，20%v/v 乙醇中稳定最好的连接肽分别为MGSSN、GGGGSEAAAKGGGGS和(GGGGS)3。本研究为耐逆的腈水解酶等化工酶在芽孢表面固定化并优化其连接肽提高固定化效果提供了一种新型的参考方法，以此满足工业上对恶劣环境下生物催化的需求。关键词： 腈水解酶，热耐受性，酸碱耐受性，酶的固定化，芽孢表面展示，连接肽目录第一章 绪论11.1 腈水解酶11.1.1 腈化物的生物催化11.1.2 腈水解酶的简介及其来源与种类21.1.3 腈水解酶的结构及其催化机理51.1.4 腈水解酶的克隆及其表达71.1.5 腈水解酶生物转化的应用81.1.6 腈水解酶未来的研究发展方向121.2 枯草芽孢杆菌孢子表面展示系统的研究进展151.2.1 研究背景151.2.2 枯草芽孢杆菌孢子固定化酶161.3 不同连接肽的研究进展及其应用171.4 研究意义191.5研究内容和技术路线191.5.1 研究内容191.5.2 技术路线20第二章 Thermotoga maritima MSB8腈水解酶的克隆表达及其纯化222.1 材料与试剂222.1.1 菌株和质粒222.1.2 工具酶和试剂盒222.1.3 其它试剂222.1.4 培养基和缓冲液232.1.5 实验仪器242.2 实验方法252.2.1 腈水解酶基因的克隆252.2.2 腈水解酶原核表达载体PET-28a