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实验一 中性粒细胞吞噬功能测定 ——细菌计数法 一、实验内容 细菌计数法测定中性粒细胞吞噬功能 微量比色测定——实验基本技能练习 二、目的与要求 1.了解中性粒细胞生物学特性及其意义。 2.熟悉“细菌计数法测定中性粒细胞吞噬功能”试验的原理、方法及用途。 1. 小吞噬细胞 来 源： 中性粒细胞 存在部位： 血液 、 炎症部位（全身） 功能基础：溶酶体，过氧化物酶及杀菌物质。 功 能：主要吞噬化脓菌 反应时间及寿命：反应时间快,数分钟到几小时，寿命短.平均数小时 血液中的多形核白细胞是一种小吞噬细胞，其细胞浆内含有多种酶类，对侵入体内的细菌具有强大的吞噬和消化功能，是机体非特异性免疫的重要组成部分。 意义：在某些情况下，小吞噬细胞也参与某些超敏反应和自身免疫疾病的组织损伤和炎症过程，因此，测定小吞噬细胞的功能可在一定程度上反映机体的免疫状态，也可作为判定疗效的一种指标。 [实验原理] [实验原理] 中性粒细胞——来源于骨髓造血干细胞； 占白细胞总数的60%~70%； 生命周期短，不能分裂，靠“造血”补充； 胞核呈多叶状；胞质内有多种颗粒； 内含髓过氧化物酶、防御素、溶菌酶、组织蛋白酶、乳铁蛋白、碱性磷酸酶等。 中性粒细胞特有，巨噬细胞没有这种酶，为中性粒细胞在细胞化学上的标志。 中性粒细胞通过趋化、调理、吞入和杀菌等步骤，吞噬和消化衰老、死亡细胞及病原微生物等异物； 中性粒细胞产生伪足包围异物——吞噬体或吞噬泡； 吞噬——呼吸爆发——产生大量过氧化物及超氧化物等毒性效应分子——杀死吞噬的细菌等异物； 同时，中性粒细胞本身也死亡，成为脓细胞。 中性粒细胞： A.在抗化脓性细菌感染中起重要防御作用； B.引起感染部位急性炎症反应； C.参与超敏反应（如III型超敏反应），引起机体免疫病理损伤。 吞噬示意图 吞噬过程 将新鲜血液和细菌混合，经合适时间后涂片染色，即能观察到被吞噬到中性粒细胞内但还未被消化掉的细菌。 检测中性粒细胞吞噬细菌的能力，可作为辅助判断机体非特异性免疫力的指标之一。 细菌计数法测定中性粒细胞吞噬功能 ——小吞噬实验 检测指标： 1. 吞噬百分率＝ 100个细胞中吞噬有细菌的细胞数 人吞噬百分率正常参考值：62%~76% 100 × 100% 2. 吞噬指数＝ 100个中性粒细胞吞噬的细菌总数 人吞噬指数正常参考值：1.32~1.72 100 (1)显微镜、香柏油、小试管、EP管、载玻片、酒精棉球、吸管、水浴箱等。 (2)肝素抗凝试管、瑞氏染液、双蒸水。 (3)菌液制备：白色葡萄球菌18～24小时内汤培养物，经Mc Farland比浊法调整浓度至6～9×109/mL，加热100℃ 15分钟杀死细菌，置4℃保存备用。 实验材料 (1)仔细消毒后，每个班取5ml静脉血于肝素抗凝管内（轻轻摇匀）。 实验方法 (3)取出EP管，用吸管吹打混匀后，取50ul“全血-白色葡萄球菌混合液”置于洁净载玻片上，用另一载玻片推片，制成血涂片。 (2)每个组(2~3人)取4滴抗凝血于EP管内，再加入100ul备好的白色葡萄球菌菌液，充分混匀后，置37℃水浴30min，中途混匀1次。 (4)待血涂片自然凉干后，用瑞氏染液染色。 瑞氏染色 瑞氏染液数滴覆盖血涂片上 染色1min 再加等量的PH6.8 PBS与染液混合，染色10~15min 用蒸馏水冲洗（平持玻片，在一端加水，使染料“漂走” ） 自然干燥 显微镜油镜原理 显微镜的放大倍数和分辨率 1.放大倍数 接物镜放大倍数×接目镜放大倍数 2. 显微镜的分辨率 表示显微镜辨析物体（两端）两点之 间距离的能力，可用公式表示为： D=λ/2n·sin(α/2 ) D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。 ?：可见光的波长（平均0.55?m) n: 物镜和被检标本间介质的折射率。 ?：镜口