第二章 基因工程制药 part2幻灯片.pptVIP

重组工程菌的遗传不稳定性的产生机制 重组质粒在受体细胞质粒分裂时的不均匀分配 这是重组质粒逃逸的基本原因 受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失 重排 四、基因工程菌的稳定性 重组质粒的逃逸率 当含有重组质粒的工程菌在非选择性条件下生长时，培养系统中一部分细胞不再携带重组质粒，这些空载细胞数与总细胞数之比称为重组质粒的宏观逃逸率。 四、基因工程菌的稳定性 重组质粒的逃逸率 重组质粒逃逸的原因有： 高温培养、表面活性剂（SDS）、药物（利福平）、 染料促进重组质粒渗透 受体细胞中的核酸酶降解重组质粒 重组质粒在受体细胞分裂时不均匀分配，细胞所含重 组质粒拷贝数的差异随着细胞分裂次数增多而加剧 四、基因工程菌的稳定性 质粒稳定性分析方法： 将工程菌培养液样品适当稀释，均匀涂布于不含抗性标记抗生素的平板培养基，培养10~12h，然后随机挑选100个菌落接种到含抗性标记抗生素的平板培养基上，统计长出的菌落数。每一个样品应取3次重复的结果，计算出比值，该比值反映了质粒的稳定性。 四、基因工程菌的稳定性 影响基因工程稳定性的因素 遗传特性 载体的性质 宿主的选择 外源基因整合到宿主染色体 发酵工艺 培养基 生长速率 限制性基质 温度 pH和溶氧 外源基因表达 四、基因工程菌的稳定性 培养基 一些基因重组菌在复合培养基中显示较高的质粒稳定性 微生物在含有有机氮源如酵母抽提物、蛋白胨等营 养丰富的复合培养基中培养时，由于培养基提供了生长 必须的氨基酸和其他物质，微生物的生长较在基本培养 基中快。 四、基因工程菌的稳定性 比生长速率 基因重组细菌的比生长速率对质粒稳定性有很大的影 响。提高比生长速率有助于提高质粒稳定性。 基因重组细菌的比生长速率与培养环境有关，如温度 、pH，溶氧，限制性营养物质浓度，有害代谢产物浓度等 。在一定的温度和pH下，限制性基质浓度往往是决定比生 长速率的主要因素。 四、基因工程菌的稳定性 限制性基质 一般培养基中各成分并不是完全平衡的，经过一段时间的培养，微生物的生长通常会受到一种或是几种物质的限制。 限制性基质的种类对重组菌有不同的影响。 四、基因工程菌的稳定性 pH和溶解氧 pH和溶氧是影响微生物生长的重要参数，在发酵罐培养基因重组菌时，通常都需要维持一定的pH和溶氧水平。在基因重组菌的高密度培养时，为了维持所需的溶氧水平，除了提高搅拌转速和通气量，往往还要在通入的空气中补充氧气，以提高发酵罐的供氧能力。 pH和溶氧影响重组酵母菌的稳定性。 四、基因工程菌的稳定性 外源基因的表达 外源基因的表达会引起重组质粒的不稳定性 外源基因高效表达时，有可能因竞争利用物质、能量、核糖体等干扰宿主细胞的正常代谢活动，并造成质 粒不稳定。 四、基因工程菌的稳定性 施加选择压力 根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素 药物和食品生产时禁止使用抗生素 加入大量的抗生素会使生产成本增加 添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定 时间 添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力 载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组分 培养基复杂，成本较高 四、基因工程菌的稳定性 改善基因工程菌不稳定性的策略 改进载体受体系统 以增加质粒稳定性为目的的构建方法包括： 将R1质粒上的parB基因引入表达型载体中 其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的 无质粒细胞 正确设置载体上的多克隆位点 禁止DNA片段插在稳定区内 将受体细胞的致死性基因安装在载体上 同时构建条件致死性的相应受体系统，如大肠杆菌的ssb 基因（DNA单链结合蛋白编码基因） 四、基因工程菌的稳定性 改善基因工程菌不稳定性的策略 分阶段控制培养 因外源基因表达造成质粒不稳定性时，可以考虑将发酵过程分阶段控制 在生长阶段使外源基因处于阻遏状态，避免因表达造 成不稳定性问题的发生；在获得需要的菌体密度后， 再去阻遏或诱导外源基因表达。 连续培养时可以考虑采用多级培养，如在第一级进行 生长，维持菌体的稳定性，在第二级进行表述。 四、基因工程菌的稳定性 改善基因工程菌不稳定性的策略 控制目的基因的过量表达 使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程 度 使用可控型复制子