(氨基酸鉴定实验报告.docxVIP

氨基酸鉴定（纸层析法）醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白实验目的1. 掌握醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白的原理和方法。2.学习氨基酸纸层析法的基本原理 3.掌握氨基酸纸层析的操作技术二．实验原理二．实验原理1）氨基酸的分离鉴定——纸层析法纸层析法（paper chromatography）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。在层析时，将样品点在距滤纸一端约2～3cm的某一处，该点称为原点；然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基酸在两相中不断分配，由于分配系数（Kd）不同，结果它们分布在滤纸的不同位置上。物质被分离后在纸层析图谱上的位置可用比移值（rate of flow, Rf）来表示。所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸停留点（又称为层析点）中心的距离（X）与原点至溶剂前沿的距离（Y）的比值： 在一定条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。2）血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳电泳的概念：带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳. 醋酸纤维是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经 乙酰化而成。涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，有强渗透性，厚度约为120微米。 醋酸纤维素薄膜电泳有以下优点：微量、快速、简便、分辨力高、对样品无拖尾和吸附现象 蛋白质是两性电解质。在pH值小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在pH值大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。血清中含有数种蛋白质，它们所具有的可解离基团不同，在同一pH的溶液中，所带净电荷不同，故可利用电泳法将它们分离。血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸祖坟、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。由表可知，血清中5种蛋白质的等电点大部分低于pH值7.0，所以在pH8.6的缓冲液中，它们都电离成负离子，在电场中向阳极移动。蛋白质名称等电点相对分子质量白蛋白4.8869000α1-球蛋白52-球蛋白5-球蛋白5.1290000~150000γ-球蛋白6.85~7300000在一定范围内，蛋白质的含量与结合的燃染料量成正比，故可将蛋白质区带剪下，分别用0.4mol/L NaOH溶液浸洗下来，进行比色，测定其相对含量。也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描，测定其相对含量。肾病、弥漫性肝损害、肝硬化、原发性肝癌、多发性骨髓瘤、慢性炎症、妊娠等都可以使白蛋白下降。肾病时α1、α2、β球蛋白升高，γ-球蛋白降低。肝硬化时α2、β-球蛋白降低，而α1、γ-球蛋白升高。实验试剂酸相容剂：V（正丁醇）：V（88%甲酸）：V（水）=15:3:2显色储备液巴比妥-巴比妥钠缓冲液：取两个大烧杯，分别称取巴比妥钠和巴比妥溶解于500ml蒸馏水中；透明液（20ml每组）：无水乙醇：冰醋酸=7：3染色液（可重复使用，使用后回收）漂洗液（100ml每组）：95%乙醇45ml，冰醋酸5ml，水50ml四．实验操作氨基酸的分离鉴定——纸层析法准备滤纸 取层析滤纸（长18㎝、宽14㎝）一张，在纸的一端距边缘2～3㎝处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2.5㎝作一记号。 2.点样用毛细管将各氨基酸样品及待测样品分别点在这5个位置上，干后重复点样2～3次。每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。 3.扩展 将滤纸粘成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20ml扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1㎝）。待溶剂上升15～20㎝时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。4.判断样品氨基酸种类根据样品及标准氨基酸的层析点判断待测样品所含氨基酸种类血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳薄膜浸泡：提前将醋酸纤维薄膜浸泡30min以上；电泳仪检查：水平检查，电源检查；电泳槽的准备：在两个电极槽中，各倒入等体积的电极缓冲液。将滤纸条对折，翻过来，用电极缓冲液完全浸湿，架在电泳槽的四个膜支架上，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内。用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱逐气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁，故称为滤纸桥。点样：取新鲜血清于载玻片上，将盖玻片掰呈适宜大小，使一边小于薄膜宽